Trametes hirsuta 漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究

关键词： 粗毛栓菌； 漆酶； 分离纯化； 染料脱色

中图法分类号： Q939.5 文献标识码： A 文章编号： 1000-2324（2024）01-0076-08

漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中（Rhusvernicifera）[1]，属于铜蓝氧化酶。漆酶来源广泛，在植物、真菌、以及少数动物和细菌中都有分布[2-3]。它以氧气为电子受体，能氧化酚类和部分非酚类化合物，且底物专一性较低，是一种环保型的天然酵素。漆酶的研究已经持续了100 多年，近年来仍是生物学、化学和环境等学科十分活跃的研究热点，其研究内容主要涉及漆酶菌株的筛选鉴定、漆酶的分离纯化、漆酶酶学性质、漆酶的结构与催化反应机理、漆酶基因的生物信息学分析、和漆酶的应用等方面[4-5]。漆酶在纸浆生物漂白、染料降解脱色、环境污染物脱毒、有机合成、生物检测等领域具有广阔的应用前景，尤其在染料废水脱色领域的应用研究取得了长足发展[6-9]。

合成染料广泛应用于纺织、造纸、印刷和化妆品行业，由于很多染料具有生物毒性甚至致癌、致畸、致突变作用，染料废水给生态环境带来了很大隐患[10]。染料废水具有产生量大、危害性强、难于生物降解等特点，而且染料通常耐光、水和氧化剂，并且难以通过物理或化学过程降解。生物酶法催化染料脱色具有条件温和、可脱色染料类型广泛、脱色效率较高、成本低等优势。因此，染料的脱色通常酶法优于物理化学方法，从而越来越多研究者开始关注酶法染料脱色[11]。酶法染料脱色主要使用的酶是木质素降解酶，如木质素过氧化物酶 （Lignin Peroxidases， LiP）、锰过氧化物酶 （Manganese Peroxidases， MnP）和漆酶[12]。其中漆酶尤其是真菌漆酶具有在自然界中分布广，作用底物广泛，催化活性高、降解彻底以及适用强等优点，已成为降解天然染料和合成染料最具潜力的酶类[13-14]。

染料根据结构分为蒽醌类染料、偶氮类染料和三苯甲烷类染料等。蒽醌类染料可直接被漆酶氧化脱色，但是有时添加介体可促进漆酶对蒽醌类染料的脱色。黄丽萍利用枝孢菌Cladosporium sp. KR14 漆酶对茜素红（蒽醌类染料）直接脱色，24 h 茜素红的脱色率为42.65%，添加介体紫脲酸（Violuric acid，VA），24 h 后漆酶对茜素红的脱色率提高到82.79%[15]。大多数偶氮类染料不能被漆酶直接脱色，借助介体可以提高漆酶对偶氮类染料脱色效率。Ma等[16]研究表明白腐真菌Ganoderma sp. En3 漆酶粗酶液对偶氮染料活性橙16 有一定的脱色效果，介体丁香醛对于活性橙16 的脱色具有显著的促进作用。部分三苯甲烷类染料可以在漆酶单独作用下进行脱色，但所需时间较长，加入介体后可以明显提高脱色效率，刘友勋利用杂色云芝Coriolusversicolor 漆酶对代表性三苯甲烷类染料孔雀石绿的脱色研究表明漆酶介体（ABTS）系统对孔雀绿的脱色效率比单独使用漆酶要高出10倍[17]。Shou-Nan Wang 等利用毛栓菌Trametes sp.F1635 漆酶与介体组成的漆酶/介体系统（Laccase mediator systems，LMS）对三种偶氮类染料（铬黑T、伊文思蓝和甲基橙）、三种三苯甲烷类染料（溴酚蓝、碱性品红和孔雀石绿）、一种蒽醌类染料（活性蓝）和一种噻嗪类染料（亚甲基蓝）进行脱色，结果表明降解伊文思蓝、碱性品红、活性蓝、甲基橙和孔雀石绿的最适介体为紫脲酸，降解铬黑T 的最适介体为乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS），而介体1-羟基苯并三唑（HBT）则对八种染料的脱色无显著促进作用[18]。由于介体成本通常较高，且合成介体具有潜在的环境毒性，不易回收，容易造成环境二次污染。因此，急需寻找无介体的漆酶催化染料脱色体系解决上述瓶颈问题。

本研究中使用的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）具有较高的漆酶生产潜力。液态培养发酵后，经硫酸铵分级沉淀和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析对Trametes hirsuta 漆酶进行了分离纯化。进一步的实验表明，Trametes hirsuta漆酶无需介体可对三苯甲烷类染料孔雀石绿和溴酚蓝进行高效脱色，显示出了Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中的较大工业应用潜力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验室保存的Trametes hirsuta 菌株。菌种接种于斜面麸皮固体培养基中4 ℃保存。将斜面保存的菌种接种于麸皮固体培养基平板上30 ℃恒温培养7 d 后，取菌体接种于麸皮液体培养基进行液态发酵，约7 d 后收集发酵液。发酵液用八层纱布过滤放入矿泉水瓶中，-20 ℃条件下冷冻过夜，再自然解冻，离心去除多糖等杂质得漆酶粗酶液。

1.2 实验方法

1.2.1 漆酶活性和蛋白浓度测定 漆酶的活性测定采用ABTS法[19]，具体过程为：以ABTS为底物，其浓度为1 mM，总反应体积为3 mL，反应体系含有2.4 mL pH 4.8，20 mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，0.45 mL ABTS 溶液和经适当稀释的酶液0.15 mL，测定波长为420 nm，消光系数为ε=36 000 M-1∙cm-1，检测温度为30 ℃，检测时间为3 min。该条件下，每分钟转化1 μmol ABTS 所需酶量定义为一个酶活单位（U）。

以牛血清蛋白作为标准品，采用Lowry 法进行蛋白质浓度的测定。

1.2.2 漆酶的分离纯化 粗酶液经硫酸铵分级沉淀后，用截留分子量为10 kDa 的透析袋，在pH 4.8，20 mM的醋酸-醋酸钠缓冲液中于4 °C透析去除硫酸铵，使用10 mL 截留分子量为10 kDa 的超滤管超滤浓缩。透析浓缩样品加载到预平衡的DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析柱上，分别用含0.1 M和0.2 M NaCl 的40 mM醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.8）进行阶段洗脱，收集洗脱液。根据核酸蛋白检测仪检测的洗脱曲线，测定蛋白峰所对应收集管中洗脱液的酶活，把酶活较高的洗脱液合并到一管，测定其酶活，取样用于SDS-PAGE电泳。

1.2.3 SDS-PAGE 电泳检测 经过上述步骤纯化的漆酶使用SDS-PAGE电泳法测定漆酶分子量、检测其纯度。SDS-PAGE 分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电泳胶用考马斯亮蓝R-250进行染色。

1.2.4 漆酶对染料的脱色 反应体系为10 mL，定量酶活，染料液和酶液体积比为1∶1，在恒温水浴锅中进行脱色反应，在染料最大吸光度下测其吸光值，根据同一染料在相同条件下吸光值的变化来求得脱色率，染料脱色率根据下式计算。

脱色率=（A₀－A_t）×100％

A₀为反应前最大吸收波长处染料溶液的吸光值；A_t为反应t 时间后最大吸收波长处染料溶液的吸光值。

10mL 的反应体系：取染料母液0.4 mL，pH 4.8缓冲液4.6 mL，酶活0.60 U/mL，30 ℃水浴，测定结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿，詹姆斯绿B6 h内的脱色率，每隔1 h测定1次。

染料浓度对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响：10mL反应体系，溴酚蓝和孔雀石浓度分别为10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，20 mM、pH 4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，酶活为1 U/mL 条件下40 ℃反应210 min，每隔30 min测1次吸光值。

温度对染料脱色率的影响：10 mL 反应体系，20 mM、pH 4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，溴酚蓝浓度为40 mg/L，孔雀石绿浓度为50 mg/L，酶活为1 U/mL，相同的反应条件下分别在30 ℃ 、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃温度时进行脱色反应210 min，每隔30 min 测染料液的吸光值，根据公式计算脱色率，比较不同温度对脱色率的影响。

pH 对染料脱色率的影响：使用pH 3.5、pH4.5、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0 浓度为20 mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，反应温度40 ℃，酶活1 U/mL，溴酚蓝40 mg/L，孔雀石绿50 mg/L，反应210 min，每隔30 min测1次吸光值。

Nacl 对脱色率的影响：反应体系中的NaCl分别为10 mM、20 mM、50 mM，溴酚蓝40 mg/L，孔雀石绿50 mg/L，40 ℃、酶活1 U/mL 时进行脱色反应210 min，每隔30 min 测1 次吸光值。

2 结果与分析

2.1 漆酶的纯化结果

漆酶各步纯化得率和纯化倍数总结为表1，酶活力总回收率为57.2%，纯化倍数6.0 倍，比活力为758.5 U/mg。

2.2 DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析

离子交换柱层析法是高度分离纯化蛋白质的技术手段。因真菌漆酶的等电点大都在酸性范围，本研究选用了DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱分离粗毛栓菌漆酶。如图1 所示，以0.1和0.2 M NaCl 洗脱时分别出现了2个主要蛋白峰，其中第一个蛋白峰的漆酶活力最高，是Trametes hirsuta 的主要漆酶部分，对该漆酶高活性组分进行收集。

2.3 SDS-PAGE电泳检测

纯化后漆酶的SDS-PAGE 电泳图谱如图2所示，电泳结果显示，纯化漆酶表现为一条蛋白带，说明已达到电泳纯，根据与标准蛋白相对分子质量对比，该漆酶的相对分子质量大概为50 kDa且为单亚基蛋白。

2.4 漆酶对染料的脱色

2.4.1 漆酶对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B 的脱色 不添加介体情况下，结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B 在30 ℃ 、pH 4.8、0.60 U/mL的酶活条件下经过6 h 脱色反应，结果发现结晶紫和詹姆斯绿B的脱色情况较差，脱色率分别为14.02%，10.13%；而溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，溴酚蓝脱色率58.18%，孔雀石绿脱色率68.33%（图3）。

2.4.2 染料浓度对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响 40 ℃、酶活1 U/mL、pH 4.8条件下对不同浓度的溴酚蓝和孔雀石绿进行210 min的脱色反应。结果表明，两者的脱色率都受染料浓度的影响（图4）。溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L、50 mg/L 时，脱色率较高，作用210 min 后脱色率分别达到60.69%、78.59%。

2.4.3 温度对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响 温度对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响结果见图5。发现反应温度在30 ℃～60 ℃条件下，随着温度升高，溴酚蓝和孔雀石绿的脱色反应速度加快，脱色率升高，但是当温度升高到70 ℃～80 ℃时漆酶对两中染料的脱色率均降低，这是因为温度越高漆酶酶活越高，但过高的温度会导致漆酶变性失活。作用210min 后，50 ℃条件下溴酚蓝脱色率最高为68.51%，孔雀石绿的脱色率最高为83.06%。

2.4.4 pH 对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响 pH对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响结果如图6 所示。结果表明溴酚蓝在pH值3.5～4.5 时脱色率较高，pH 值为3.5 时脱色率最高达到72.61%；孔雀石绿在pH 值4.5～6.0 时脱色率较高，pH 值为4.5 脱色率最高达到83.49%。Trametes hirsuta漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿脱色的最适pH 值不同，可能是因为这两种染料在不同的pH 值下具有不同的稳定性。

2.4.5 NaCl 对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响 如图7 所示，NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率具有显著影响，两种染料脱色率随NaCl 浓度的增高而降低，表明NaCl 对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色反应具有抑制作用，对溴酚蓝脱色率的影响尤为显著，这种抑制作用可能源于Cl-对漆酶活性具有抑制作用导致的。

3 讨论

本研究采用两步纯化法，通过硫酸铵分级盐析沉淀和 DEAE-Sepharose FF 层析纯化，成功获得了高纯度的漆酶样品，漆酶活性回收率高达57.2％，纯化倍数达到6.0倍，比活力为758.5 U/mg。相比之下，刘芹等[20]通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析从白灵侧耳菌渣中分离纯化漆酶，经过各步纯化后最终漆酶活力总回收率为18.8%，比活力为176.1 U/mg；Si 等[21]经过盐沉淀、离子交换层析和分子筛层析三步操作对南方灵芝Dai 11646漆酶进行纯化，最终漆酶回收率为38.44%，比活力为22.214 U/mg；Manavalan等[22]通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-100 层析和DEAE-cellulose 层析对灵芝Ganoderma lucidum 分泌的漆酶进行了纯化，漆酶活性回收率为32%，纯化倍数为5.57 倍，比活力为145 U/mg。由此可见本研究的两步纯化Trametes hirsuta 漆酶法具有可行性强、操作简单、方便、酶活回收率高等特点。这对于Trametes hirsuta 漆酶的应用和开发具有重要的意义，同时也为其他酶类的提取和纯化提供了参考和借鉴。

本研究使用漆酶粗酶液脱色法，在实用性及经济性方面更具优势，能够更好地满足实际应用需求。Trametes hirsuta 所产漆酶粗酶液对不同染料有不同脱色能力，其对溴酚蓝和孔雀石绿这两种染料的脱色效果较为显著（图3）。Trameteshirsuta 漆酶在无介体存在时，1 h 对孔雀石绿的脱色率在17%以上，6 h脱色率在60%以上（图3）。郭艳华等利用竹黄菌S8漆酶降解孔雀石绿，在无介体存在时，1 h 对孔雀石绿的脱色率6.45%[23]。刘友勋利用杂色云芝Coriolus versicolor 漆酶在添加介体ABTS 条件下10 h 对孔雀绿的脱色效率为60%左右[17]。可见Trametes hirsuta 漆酶在工业染料废水的处理上效率较高。温度是影响漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的重要因素，过高或过低的温度都会影响酶的稳定性和活性，从而降低脱色率，选择适当的脱色温度可以提高漆酶对染料的脱色率。此外，脱色体系的pH 值也对酶的活性产生显著影响，不同染料的最适pH值也不同，因此应根据染料的特性选择适合的pH 值。在染料脱色过程中，添加NaCl 会对Trametes hirsuta 漆酶的活性产生抑制作用，NaCl浓度越高，抑制作用越强，从而降低其对染料的脱色率，这种抑制作用可能源于Cl- 对该Trametes hirsuta 漆酶活性具有抑制作用导致的。这与郝龙云等人研究结果相符，郝龙云等研究表明漆酶的脱色性能随所添加的盐类不同而有显著差异，Na2SO4对漆酶活性影响较小，而NaCl、KCl 对漆酶活性有抑制，随着NaCl、KCl 质量浓度的增大，漆酶对活性艳蓝K-3R脱色率逐渐下降，这种差异可能是由于酸根离子的不同而造成[24]。在实际应用中，需要消除抑制因素，增加促进因素，以提高漆酶的脱色效率。

大多数真菌漆酶需要在添加某种介体的情况下，才能对孔雀石绿等三苯甲烷类染料达到不错的脱色效果[17，23，25]。但是介体价格往往比较昂贵，大大制约了真菌漆酶的工业化脱色应用。但Trametes hirsuta 漆酶对孔雀石绿和溴酚蓝进行脱色时无需介体，在相对较短的时间内就达到了较好的脱色效果（图3）。因此利用Trameteshirsuta 漆酶可降低脱色成本，使其更具有工业化应用价值和潜力。

4结论

漆酶作为一种具有广泛应用前景的生物催化剂，在多个领域中都具有重要的应用价值。本研究高效的分离纯化了Trametes hirsuta 漆酶，并对其染料脱色能力进行了深入的探究，研究发现该漆酶在不添加介体情况下对溴酚蓝和孔雀石绿等染料具有显著的脱色能力，为实现漆酶的染料脱色实际应用提供了理论数据支持。研究结果对于开发Trametes hirsuta 漆酶在染料废水处理和其他生物技术领域的应用具有重要的意义，进一步的研究可以探索该漆酶的催化机制以及其在环境保护和工业生产中的潜在应用。