利用冷冻扫描电子显微镜观察金纳米颗粒原位标记红细胞膜阴离子通道蛋白

关键词带3蛋白；冷冻扫描电子显微镜；金纳米颗粒；原位标记；蛋白分布；蛋白岛

膜蛋白在细胞生命活动中发挥着重要作用，包括物质运输、细胞信号转导和细胞黏附等[1-4]。膜蛋白的功能与其在细胞膜上的空间结构位置密切相关，研究表明，膜蛋白倾向于聚集成蛋白簇发挥其生理功能[5-7]，然而，膜蛋白在细胞膜上的精确结构位置目前尚不清楚。在天然状态下，对细胞膜进行成像并精准定位膜蛋白对于深入理解膜蛋白在细胞生理活动中的功能机制具有重要意义。

在以往的研究中，荧光显微镜通常被用于研究细胞中特定蛋白的空间分布[8-10]，采用光学显微镜观察抗体连接的荧光分子，对抗体所标记的蛋白进行定位成像。但是，即使是非常先进的超分辨显微成像技术，其分辨率也只能达到约20nm，而膜蛋白本身的直径只有8nm左右，因此，很难采用光学显微镜精确绘制细胞膜蛋白的分布图谱[11-12]。

红细胞是血液中数量最多的一类细胞，是人体内传输氧气和二氧化碳的主要媒介[13-14]。红细胞通常呈双凹圆盘状，这种形状不仅可增大其气体交换面积，还可在穿过口径更小的毛细血管时快速进行形变和恢复[15]，而红细胞变形能力的改变会导致体内氧气传输效率以及血流速率下降，引发一系列心血管疾病和代谢疾病。因此，红细胞膜和膜蛋白是许多疾病研究的重要靶标[16-18]。

带3蛋白（Band3protein）是红细胞膜上的阴离子通道蛋白，介导HCO3–/Cl–的跨膜交换，这是机体呼吸在细胞水平的基础过程[19-20]；此外，带3蛋白还与红细胞的骨架相连，有助于维持细胞形状[21]。近年来，有关带3蛋白结构与功能的研究取得了一系列进展，2015年确定了其晶体结构，证实了带3蛋白含有14个具有复杂拓扑结构的α-螺旋跨膜片段[22]；2022年，Xia等[23]通过冷冻电镜解析了带3蛋白相关的锚蛋白复合物的原子级分辨率结构，阐述了其在红细胞形成过程中可能的组装方式。然而，生理状态下带3蛋白在红细胞膜上的精确空间分布目前尚不清楚。

扫描电子显微镜常用于对样品微区的形貌进行高分辨率分析，其原理是利用聚焦的电子束在样品表面进行光栅式扫描，通过收集样品表面被激发出的信号观察并分析样品的表面形貌，具有成像直观、分辨率高、放大范围广等优点。然而，传统的扫描电镜要求样品干燥且不易挥发，但生物样品在经历脱水干燥等过程后通常无法维持其原始的生理结构[24-25]。冷冻扫描电子显微镜可有效地解决此问题，超低温样品制备和成像技术使得细胞和生物组织等含水样品可经过快速冷冻后再进行扫描电镜观察，并可维持其原本的结构状态[26]。

为了探究带3蛋白在红细胞膜上的精确定位和分布特征，本研究利用冷冻扫描电子显微镜对近生理状态下的红细胞膜进行成像，结合金纳米颗粒（Goldnanoparticles，GNPs）具有良好的导电性和生物相容性的特点[27]，通过构建抗体-GNPs复合物，标记出红细胞膜上的带3蛋白。本研究高分辨地展现了红细胞膜表面的形貌特点，同时观察到了GNPs所标记的带3蛋白在红细胞膜上的空间分布，为进一步理解带3蛋白的结构分布与功能机制提供了参考。

1实验部分

1.1仪器与试剂

Sigma300扫描电子显微镜（德国蔡司公司）；PP3010T扫描电镜冷冻制样及传输系统（英国Quorum公司）；BioScopeResolve生物型原子力显微镜（美国布鲁克公司）；TGL-21M高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；单晶硅片（10mm×10mm，中镜科仪公司）。

NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O（分析纯，北京化工厂）；Au-PEG1000-COOH（50mg/mL，西安瑞禧生物公司）；带3蛋白抗体（200mg/mL，美国Invitrogen公司）；1-3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（99%，美国Sigma公司）；N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1抗体修饰的GNPs的制备

取1mLAu-PEG1000-COOH（50mg/mL），按照n（—COOH）∶n（EDC）∶n（NHS）=1.0∶1.5∶1.5的比例加入EDC和NHS[28]，混匀，再加入10μL抗体（200mg/mL），室温下连接反应4h，60000r/min离心1h，弃去上清液以去除未连接的抗体，加入1mL低渗PBS缓冲液（7.5mmol/L，pH7.5）重悬。

1.2.2GNPs标记人血红细胞膜

参考文献[5]的方法制备单层人血红细胞膜。首先将硅片硅烷化：用乙醇将硅片超声清洗干净，干燥后，将硅片和2个干净的小皿放在干燥器中，通入氩气5min，在氩气环境中向2个小皿中分别加入15μLDIPEA和50μLAPTES，再持续通入氩气5min，密闭干燥，室温放置4h以上。取20μL新鲜人指尖血，在PBS缓冲液（150mmol/L，pH7.5）中离心（1000r/min，2min）、清洗5次，弃上清液，加入10mLPBS缓冲液，混匀，滴加在硅烷化的硅片上，沉降30min，使红细胞黏附在硅片上。用PBS缓冲液洗去未贴附的RBC，利用注射器及针尖形成的快速低渗PBS缓冲液柱剪切开红细胞，去除顶端膜，获取单层红细胞膜。此时，红细胞膜的细胞质侧是向上的，采用低渗PBS缓冲液洗涤红细胞膜5min，去除残余骨架，再将细胞膜连同硅片放入小皿中，加入低渗PBS缓冲液浸没。取1mL1.2.1节制备的抗体-GNPs连接产物加入小皿中，总体积为3mL，4℃孵育过夜。孵育完成后，将小皿中的溶液吸出，先后采用低渗PBS缓冲液和0.3mol/LNaCl溶液进行清洗，去除非特异性吸附的GNPs。

1.2.3非特异性吸附的GNPs清洗对照实验

制备两组相同的细胞膜样品，步骤与1.2.2节相同，向小皿中直接加入1mLAu-PEG1000-COOH，总体积为3mL，4℃孵育过夜。将小皿中的溶液吸出，第一组先后采用低渗PBS缓冲液和0.3mol/LNaCl溶液进行清洗，第二组仅采用低渗PBS缓冲液进行清洗。

1.2.4红细胞膜的冷冻扫描电子显微镜成像

采用液氮泥快速冷冻的办法制备冷冻样品[26]，随后转移至冷冻传输装置中，提升温度至–95℃并维持10min，使表面的冰升华以暴露出细胞膜，再采用扫描电镜观察。扫描电镜成像采用镜筒内电子探测器（In-lens模式），电压选择0.5～3.0kV，工作距离lt;2mm。

1.2.5红细胞膜的原子力显微镜成像

采用SCANASYST-FLUID+原子力扫描探针以峰值力成像模式探测红细胞膜胞质侧结构，扫描速度为0.4Hz，扫描密度为256×256像素。数据采用NanoScopeAnalysis和Gwyddion软件进行分析和处理[29]。

1.2.6数据分析

通过观察所获图像中GNPs的位置，可得出特异性标记的带3蛋白的空间分布。采用MATLAB软件对数据进行分析，处于预定距离内的点被视作一个蛋白簇。分析细胞膜上蛋白簇的特征，包括蛋白簇的密度和蛋白簇所含的蛋白数量。

2结果与讨论

2.1冷冻扫描电镜对红细胞膜进行成像

人血红细胞膜的厚度约为10nm，主要由磷脂和蛋白质组成，组成元素主要为C、H、O、N和P等不导电的轻元素[30]。为了得到更好的红细胞膜扫描电镜图像，实验中未对细胞膜表面进行导电喷涂，最大限度地保留其原始形貌，同时通过低电压减少荷电效应和对样品的破坏，设置尽可能小的工作距离，并采用In-lens模式收集样品极表面的信号，进而获得真实且高分辨率的图像[31]。图1A展示了冷冻扫描电镜下的单个红细胞膜，直径约为8μm，符合人血红细胞的直径大小范围，表面可看见较暗衬度的凸起，并紧密连接，在膜上形成了交叉网络状分布（图1A和1C），结合细胞膜表面成分，这些黑色的凸起应为细胞膜胞质侧表面的膜蛋白，单个膜蛋白的直径多在6～8nm范围内，而这些膜蛋白复合体的直径主要分布在65～120nm之间，说明膜蛋白在细胞膜表面倾向于紧密联系并形成蛋白簇，也可称之为“蛋白岛”，这与之前对膜蛋白的研究结果相符[5-7]。本研究组曾通过原子力显微镜在单分子层面对生理状态下的红细胞膜进行成像，并提出了红细胞膜的Semi-mosaic模型[5]，为了验证本研究成像的真实性及可靠性，采用原子力显微镜对同一细胞膜样品进行成像（图1B），所得的原子力显微图像与以往研究结果相类似，原子力显微成像中较高的蛋白颗粒与扫描电镜成像中较暗衬度的形貌也可一一对应。此外，由于In-lens模式成像的立体效果差，为了观察膜蛋白的高度，将黏附了样品的硅片从中间断裂，倾斜80°进行成像，可以见到高度约10nm的膜蛋白（图1E），而原子力显微镜对膜蛋白的高度测量在6～8nm左右（图1D），这个差距可能是因为在冷冻制样过程，虽然对细胞膜表面的冰进行了升华，但仍有一层很薄的冰（2～4nm）包裹了膜蛋白，有利于保护细胞膜不受电子轰击的破坏。

综上，利用冷冻扫描电子显微镜对细胞膜进行成像是一种高效可行的细胞膜研究方法。本研究通过冷冻扫描电子显微镜观察到了生理状态下的人血红细胞膜及膜蛋白的形貌，显示出膜蛋白在细胞膜上成簇的网络状分布。

2.2GNPs标记人血红细胞膜上的带3蛋白

GNPs常用于生物物理学、医学诊断和治疗等领域的研究[32]，具有良好的生物相容性；同时，GNPs具有导电性和较高的电子密度，可广泛应用于生物电镜成像领域。蛋白质在细胞内特定位置的分布模式直接影响细胞的结构和功能，带3蛋白在红细胞膜蛋白中占比最高，并且直接参与了红细胞气体交换与运输这一基本生理过程，探究带3蛋白在生理条件下的分布状态有助于理解其在细胞水平上的功能机制。

本研究选择PEG1000-COOH包被的GNPs，PEG1000可对GNPs进行包裹，减少非特异性吸附[33]，—COOH可用于连接带3蛋白抗体，使GNPs通过抗原-抗体的相互作用实现对带3蛋白的标记。带3蛋白的直径约为6nm，大粒径的GNPs有可能会导致相邻分布的带3蛋白由于GNPs自身空间位阻的原因而遗漏标记；但是，如果选择粒径过小的GNPs，除了孵育过程中GNPs自身的稳定性易被破坏外，扫描电镜成像效果也会大幅降低。综合考虑实验的稳定性、成像清晰度和蛋白自身的大小等因素，本研究选择5nm的GNPs对带3蛋白进行标记，实验过程见图2A。在抗体修饰过程中，抗体的添加量远大于GNPs，多余的抗体会通过离心去除，得到GNPs标记的带3蛋白。

GNPs与蛋白之间可非特异性吸附，PEG1000的包被可在一定程度上减轻该吸附；同时，在清洗过程中加入了高浓度盐溶液，去除非特异性吸附的GNPs，并通过未连接抗体的GNPs的对照实验进行了验证（图3A和3B），因此，可以认为这些GNPs的定位代表了细胞膜上带3蛋白的分布位置。标记GNPs后的人血红细胞膜整体形貌与标记前相似（图3C），说明在标记过程中很好地维持了细胞膜的生理状态，当提高放大倍数后，在图像中清晰可见5nmGNPs均匀地分布在整个细胞膜上，并且都定位在衬度较暗的蛋白区域（图3D和3E）。将这些GNPs的坐标提取出来进一步分析，由于带3蛋白的直径约为6nm，考虑到GNPs与带3蛋白的相对位置并不清楚，本研究以2个带3蛋白的直径（12±2）nm为GNPs之间距离的阈值，将在此范围内的点划分为一簇，发现1/2的带3蛋白会形成不同数量的蛋白簇，图3F展示了划分结果，同一颜色的点代表相同的簇。对比原始图像（图3E）与划分结果（图3F）可知，同一簇内的带3蛋白均属于一个蛋白岛。基于DBSCAN算法对这些簇进行聚类分析[34]，得出每个聚类中带3蛋白的典型数量（主要为2～3个，图3G）和聚类密度（（40.1±2.8）Cluster/μm2，图3H）。

研究表明，带3蛋白、4.2蛋白与锚蛋白会形成大的锚蛋白复合体，有助于维持红细胞的形状和完整性，而带3蛋白通常从形成二聚体开始，通过与4.2蛋白相互作用而形成不同的亚复合物，最终形成完整的锚蛋白复合物[23]。在本研究中，带3蛋白的二聚体数量最多（67%），这也说明了带3蛋白通常以二聚体形式结合其它蛋白成为复合体而发挥作用，聚集体多达40个/μm2，确保红细胞保持双凹圆盘形的状态，并在变形后可迅速通过遍布细胞膜的致密网络状分布的锚蛋白复合体恢复原本的形状，从而继续行驶其生理功能。但是，红细胞膜上也存在较多的单体和三聚体，说明二聚体并不是带3蛋白发挥作用的唯一形式。除了维持红细胞的形态外，带3蛋白还介导了机体气体运输的离子交换，在这个过程中带3蛋白极有可能是作为单体与其它蛋白发生相互作用而实现此生理功能。总之，本研究通过GNPs偶联抗体标记带3蛋白并利用冷冻扫描电镜技术对细胞膜进行成像，可得到带3蛋白在细胞膜上的定位，并绘制带3蛋白的分布图谱（图2B）。结果表明，带3蛋白在细胞膜整体上均匀密集分布，在蛋白岛中主要以单体和二聚体形式存在，这也有利于带3蛋白与其它蛋白相互作用，发挥其生物学功能，此结果有助于研究者深入理解带3蛋白的作用机理，揭示机体在进行基本的气体交换的生理过程中带3蛋白与其蛋白复合体发挥的关键作用。此外，带3蛋白与多种疾病相关，包括心脑血管疾病和代谢疾病等，了解带3蛋白的分布有助于相关药物的设计和研发。在后续研究中，通过研究蛋白质在疾病状态下的分布变化，可以发现潜在的疾病机制，并为建立治疗策略提供参考。

3结论

膜蛋白在细胞膜上的空间分布与细胞的许多功能和重要生物过程密切相关。本研究采用冷冻扫描电镜对人血红细胞膜的胞质侧进行了高分辨率的形貌观察，通过低温成像技术以及细胞膜的液氮快速冷冻技术，确保了细胞膜及膜蛋白的近生理状态。GNPs具有优越的导电性和电子密度，可作为电镜成像标志物；同时，GNPs良好的生物相容性可以维持细胞膜结构不被破环，抗体与GNPs的偶联使GNPs可特异性地标记带3蛋白。结果显示，膜蛋白在人血红细胞膜上呈网状聚集分布，形成了不同尺寸的蛋白岛，带3蛋白在整体上均匀分布在细胞膜上的蛋白岛中，并在蛋白岛中形成小的聚集体，可作为功能微区发挥相应的生理功能。本研究精确地绘制出了人血红细胞膜胞质侧的蛋白岛形貌图，同时定位了带3蛋白在细胞膜上的分布。GNPs标记与冷冻扫描电镜的结合可以精确定位特定蛋白质在细胞膜上的位置，为进一步研究蛋白质岛的结构组成以及细胞膜功能与蛋白质岛之间的关系提供了新的研究方法和证据；同时，增加了对膜蛋白分布模式的了解，有助于在分子和细胞水平上深入认识结构与其功能的关系，为疾病治疗和药物开发提供参考。