镧系金属-有机框架免修饰荧光各向异性探针检测磷酸根离子

关键词荧光各向异性；探针；发光金属-有机框架；镧系金属-有机框架；磷酸根离子

荧光各向异性（Fluorescence anisotropy， FA）是荧光分子的固有属性。当荧光分子定向排列后，荧光分子发出的荧光具有各向异性。此时，采用取向垂直和水平的检偏器即可检测到不同的荧光强度。FA检测属于均相分析方法，具有以下优点：（1）不需要分离和洗涤等步骤，操作简便[1-2]；（2）可直接和实时测定荧光探针的结合/解离速率[3]；（3）易于实现高通量和自动化分析检测[4-5]；（4）探针设计简单，只需要一个荧光分子标记[6]；（5）抗光漂白和抗荧光波动的能力强。根据Perrin 方程，当荧光寿命、溶液的粘度和温度保持不变，荧光体的体积（或质量）增大时， FA 值（r）增大；当荧光体的体积（或质量）减小时，r 减小[7-8]。通过检测反应前后荧光体的分子体积（或质量）的改变可实现对分析物的高灵敏检测。目前，FA 探针主要分为三类：有机染料[9-14]、过渡金属配位化合物[15]以及荧光纳米粒子[16]。然而，由于分析物的体积或质量较小，与探针结合不能引起明显的r 的改变，因此，研究者通常采用具有大体积或质量的纳米材料（如金纳米颗粒[17]、银纳米颗粒[18]、碳纳米颗粒[19]、碳纳米管[20]和氧化石墨烯[21]等）放大探针的FA 信号，进而提升检测灵敏度。然而，这些方法也存在一些弊端：这些纳米材料易通过电子转移或荧光共振能量转移猝灭荧光，导致r 易受散射干扰而降低检测准确度；大多数方法中的荧光探针需要复杂的修饰步骤，例如以金纳米颗粒放大FA 信号需将DNA 通过化学键修饰到纳米颗粒表面，其过程较复杂。因此，非常有必要开发不需要放大体积和质量且不需要修饰的新型FA 探针。

金属-有机框架（Metal-organic framework， MOFs）是一种将金属离子/团簇和有机配体通过配位键连接而成的晶体多孔材料[22]，因其结构和功能可定制，并具有超高的孔隙率和大表面积，在催化[23]、气体储存和分离[24]、药物递送[25]、分离科学[26]和生物传感[27]等领域得到了广泛应用[28-29]。其中，发光金属-有机框架材料（Luminescent MOFs， LMOFs）因具有独特的发光性能而备受关注[30-31]。在MOFs 的结构中同时包含金属离子/团簇与有机配体两个部分，因此，可以通过调节金属离子/团簇及有机配体的比例及种类，使MOFs 材料具有丰富且可调的发光性能。LMOFs 材料的刚性结构使其容易设计传感的反应位点，并且兼备无机及有机材料的特性，在结构与性能方面具有良好的设计性及可调节性，适用于不同的检测环境，呈现出巨大的应用潜力。更重要的是， LMOFs 本身的体积（或质量）较大，具有较强的r，不需要额外的信号放大材料，因此可作为一种潜在的FA 探针。

磷酸根离子（Pi）是水生微生物营养链的重要组成部分，当发生富营养化时，磷酸盐会耗尽溶解氧，导致植被和水生生物腐烂和死亡。在一定程度上， Pi 是一种方便的水体有机污染指示剂或示踪剂， Pi 的检测对于控制和防范水体富营养化的发生具有重要意义。Pi 的分析方法包括分光光度法[32]、荧光法[33]、色谱法[34]、电化学分析法[35]和酶生物传感器[36]等，然而，以上方法存在诸如准确度不高、定性能力较差、选择性较差和实验条件要求严苛等问题。因此，开发一种简单快捷并具备高灵敏度与高选择性以及成本较低的Pi 检测方法具有重要的意义。

基于此，本研究采用一种新型FA 探针镧系金属-有机框架（Ce-TCPP MOF）检测Pi（图1）。首先，以Ce3+为中心离子、5，10，15，20-四（4-羧基苯基）卟啉（H2TCPP）为配体，通过微波辅助法合成了在662 nm 处有荧光发射的Ce-TCPP MOF 材料[37]。制备出的Ce-TCPP MOF 纳米薄片在溶液中的旋转扩散速率较低，导致其自身具有较强的r；加入Pi 后， Pi 会与MOF 中的金属离子Ce3+发生反应，致使Ce-TCPP MOF 结构破坏，其体积或质量显著减小，降低了r。因此，可以通过检测r 的降低值（Δr）实现Pi 的检测。本方法操作简便，检测时无需引入其它材料进行信号放大即可实现Pi 的高灵敏度与高选择性检测，在环境监测领域具有潜在的应用价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500 荧光分光光度计（带偏振片）、S-4800 扫描电子显微镜（SEM）和UV-3010 分光光度计（日本日立公司）；IRPrestige-24 红外光谱仪（FTIR，日本岛津公司）；JEM1200EX 透射电子显微镜（TEM，日本JEOL 公司）；BX51 光学显微镜、U-DCW 暗场聚光镜、100 倍放大的油浸物镜和DP27 单芯真彩CCD 相机（日本Olympus 公司）；Dimension Icon 原子力显微镜（AFM）和D8 ADVANCE X-射线衍射仪（XRD）（德国布鲁克斯公司）；250Xi X-射线光电子能谱（美国赛默飞公司）；M1-L213B 家用微波炉（美的股份有限公司）

六水合硝酸铈（Ce（NO3）3·6H2O， 99.95%）、乙酸（HAC， AR 级， 99.5%）和5，10，15，20-四（4-羧基苯基）卟啉（H2TCPP， 97%）购自阿拉丁公司；无水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF， 99.5%）和十二水合磷酸钠（Na3PO4·12H2O， AR 级， 98%）购自川东化工股份有限公司；曲拉通TX-100 和Tris-HCl 缓冲液（1 mol/L）购自生工生物工程股份有限公司。所有化学试剂均直接使用，未进一步纯化；实验用水均为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 实验方法

1.2.1 Ce-TCPP MOF的合成[37]

将39.1 mg Ce（NO3）3·6H2O和23.7 mg H2TCPP分别溶于9 mL DMF中，然后将100 μL Ce（NO3）3·6H2O、100 μL H2TCPP 和15 μL HAc 分别加入3 mL 玻璃小瓶中，用DMF 稀释至1 mL。将盖好盖子的小瓶放入微波炉中低功率（约231 W）微波照射加热10 min。将得到的纳米片冷却至室温后，分别用DMF 和乙醇各洗涤2 次，然后以14000 r/min 离心5 min。最后，将得到的Ce-TCPP MOF 重新分散在乙醇中。

1.2.2 FA的测定

采用配有偏振片的荧光分光光度计测量不同偏振方向上的荧光强度。激发波长为420 nm，发射波长为662 nm；激发和发射狭缝宽度均设置为5 nm；积分时间设置为2 s。样品池采用石英池， FA 测量实验均在室温下进行。根据公式（1）和公式（2）计算r：

其中， IVV 和IHH 分别为垂直偏振光激发后垂直和水平偏振光发射的荧光强度；IHV 为起偏器为水平方向而检偏器为垂直方向时的荧光强度；IVH 为起偏器为垂直方向而检偏器为水平方向时的荧光强度；仪器校正因子G 为校正了垂直和平行发射路径的不同检测效率。

1.2.3 Pi检测实验

由于Ce-TCPP MOF 具有较大的尺寸，在溶液中易团聚沉淀，因此在实验过程中加入表面活性剂TX-100 阻止其团聚。在室温条件下，将20 μL 1 mg/mL Ce-TCPP MOF、10 μL 1% TX-100、70 μL 超纯水以及100 μL 含有不同浓度Pi 的Tris-HCl 缓冲液（20 mmol/L， pH=7.0）混合，反应30 min，按照1.2.2 节的方法测定并计算不同样品的r。

1.2.4 实际样品检测

实际水样为嘉陵江下游北碚段江水样品。水样自然沉淀12 h 后取其上层清液，离心，去除不溶物后，将其调至pH=7，备用。将20 μL 1 mg/mL Ce-TCPP MOF、10 μL 1% TX-100、70 μL 处理后的实际水样与100 μL Tris-HCl 缓冲液（20 mmol/L， pH=7.0）混合，反应30 min， 测定并计算不同样品的r。

2 结果与讨论

2.1 Ce-TCPP MOF 的表征

由Ce-TCPP MOF 的SEM 图（图2A）和TEM 图（图2B）可见， Ce-TCPP MOF 呈边缘清晰、大小均一的片状结构。AFM 图（图2C）表明， Ce-TCPP MOF 为具有一定厚度的纳米薄片。在紫外灯照射下， Ce-TCPPMOF 的乙醇分散液呈现红色荧光（图2D）。由于H2TCPP 的平面大环结构能提供π→π*跃迁，使得H2TCPP及其衍生物在可见光区具有荧光响应，因此，以420 nm 为激发波长， Ce-TCPP MOF 的乙醇分散液分别在662 和712 nm 附近出现了荧光发射峰（图2E），这与H2TCPP 的乙醇分散液出峰位置一致（图2F）。

在FTIR 光谱图（图3A）中， 1689 和1604 cm–1 处的峰为H2TCPP 单体中C=O 的不对称伸缩振动特征峰，当H2TCPP 与Ce3+配位后，特征峰分别位移至1581 和1527 cm–1，并且强度显著降低；在Ce-TCPPMOF 的红外光谱图中可以观察到1261 cm–1 处C—O 的伸缩振动峰消失。这些结果表明， Ce-TCPP MOF是由Ce3+与H2TCPP 中的羧基配位而构建的。粉末X-射线衍射（PXRD）研究（图3B）表明， Ce-TCPP MOF属于正交晶系中Cmmm 空间群。Ce 原子采用类八面体配位模式， 4 个桥接羧基分别来自4 个不同的TCPP 连接子， 2 个氧原子来自μ2-OH 基团，沿a 轴方向形成CeO4（OH）2 链。卟啉中心无金属，几乎是平面的，没有明显的面外变形[37]。

通过比较H2TCPP 与Ce-TCPP MOF 的XPS 谱图（电子版文后支持信息图S1A）发现，当H2TCPP 与Ce3+形成Ce-TCPP MOF 后， Ce 3d（电子版文后支持信息图S1B）在882.7、886.1、888.8、900.6、904.7 和907.5 eV 处的峰发生了不同程度位移，这表明H2TCPP 配体中的羧基与Ce3+节点成功配位；同时，Ce-TCPP MOF 的N 1s 谱图（电子版文后支持信息图S1C）与H2TCPP 相比没有明显偏移，表明卟啉环没有被金属化；并且O 1s 谱图（电子版文后支持信息图S1D）中的C=O 和C—OH 基团在531.8 和533.1 eV处的峰也分别位移至531.2 和533.3 eV 处。

2.2 Ce-TCPP MOF 检测Pi的性能研究

2.2.1 Ce-TCPP MOF 对Pi的响应

为了探究Ce-TCPP MOF 对Pi 的响应，测定了Ce-TCPP MOF 在加入Pi 前后的r。如图4A 所示，未加入Pi 时， Ce-TCPP MOF 具有较大的r；加入Pi 后， MOF 中的Ce3+与Pi 发生反应， r 降低。因此，利用Ce-TCPP MOF 显著降低的r 可以实现Pi 的灵敏检测。

为了研究Pi 与Ce-TCPP MOF 之间的反应，对二者反应后的产物进行了测定与表征。加入Pi 后，混合体系的荧光显著增强（图4B），表明Ce-TCPP MOF 被Pi 破坏，产生了游离的TCPP。SEM 图像显示，Ce-TCPP MOF 与Pi 反应后，其二维片状结构转变为粒径较小的不规则结构，表明MOF 空间结构被Pi 破坏（图4C）。此外，对Ce-TCPP MOF 与Pi 反应后的产物进行了分析。在FTIR 光谱图（电子版文后支持信息图S2A）中，属于Ce-TCPP MOF 的特征峰消失，产物在1085 cm–1 处出现较强的PO4 反对称伸缩振动峰。PXRD（电子版文后支持信息图S2B）和XPS（电子版文后支持信息图S2C）结果证明了Pi 与Ce-TCPPMOF 反应后的产物为CePO4，表明Pi 与Ce-TCPP MOF 中的Ce3+发生反应，导致MOF 裂解， r 降低。采用暗场显微镜实时观察了Ce-TCPP MOF 与Pi 之间的反应，结果表明，随着反应的进行， Ce-TCPP MOF 的暗场散射图像发生了显著变化：0 min 时， Ce-TCPP MOF 具有较强的散射光以及明显的片状特征性结构（图4D）；15 min 时， Ce-TCPP MOF 散射光强度有所下降（图4E）；30 min 时， Ce-TCPP MOF 散射光强度降到最低，并且边界处发生裂解（图4F），这进一步证明了Pi 能破坏Ce-TCPP MOF 的结构。

2.2.2 Pi检测条件的优化

为了获得良好的Pi 检测性能，考察了反应体系中溶液pH 值、反应时间（t）与MOF 浓度（CMOF）对Pi检测的影响。首先，对溶液的pH 值进行优化，结果如图5A 所示。当溶液pH 值从6.8 增至9.0 时， Δr 先增加后降低；当pH=7.0 时， Δr 最大。由于大多数金属阳离子对OH‒的亲和力高于羧酸盐的亲和力，导致由高价金属构成的羧酸MOFs 在碱性环境中会逐渐降解[38]，所以随着溶液的pH 值增大， Ce-TCPPMOF 的r 降低。因此，选择pH=7.0 进行后续实验。对Pi 的检测时间进行了优化，选择最佳反应时间为30 min（图5B）。MOF 浓度的影响如图5C 所示，可见随着MOF 浓度逐渐增大， Δr 呈现先增大后减小的趋势，当MOF 浓度为100 μg/mL 时， Δr 最大。

2.2.3 方法对Pi的检测性能

在最佳条件下，采用本方法测定不同浓度的Pi 所产生的Δr。如图6 所示，随着Pi 浓度增加，Ce-TCPP MOF 的Δr 逐步增大， Δr 与Pi 浓度在0.5～3.5 μmol/L（0.016～0.108 mg/L）范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为Δr=0.066C（μmol/L）–0.017（R2=0.99）。检出限（LOD， 3σ/k）为0.41 μmol/L。与已报道的方法相比（表1），本方法的检出限相当或更低，并且本方法操作简便，无需制备复杂的荧光探针，成本较低。

2.2.4 选择性与抗干扰性

真实水体的组成相对复杂，通常存在多种阴离子，并可能与Pi 形成竞争关系，从而影响Ce-TCPPMOF 对于Pi 的检测。选取水体中常见的共存阴离子（Cl‒、Br‒、NO3‒、CO32‒和SO42‒），考察其对本方法检测Pi 的影响。如图7A 所示，在相同的实验条件下，向Ce-TCPP MOF 中加入上述常见的共存阴离子后， r 只有很小的变化；向Ce-TCPP MOF 中加入相同浓度的Pi 后， r 显著降低。SEM 图显示， Ce-TCPPMOF 与上述阴离子反应后，其二维片状结构并未发生改变（电子版文后支持信息图S3）。通过暗场显微镜实时观察Ce-TCPP MOF 与上述常见共存阴离子之间的反应，随着反应进行， Ce-TCPP MOF 的暗场散射图像也并未发生变化（电子版文后支持信息图S4）。加入Pi 后， Ce-TCPP MOF 结构遭受破坏，产生游离的TCPP，使混合体系产生了明显的荧光增强现象，加入上述常见共存阴离子后，混合体系的荧光并未增强（电子版文后支持信息图S5），再次证明了Cl‒、Br‒、NO3‒、CO32‒和SO42‒并不会破坏Ce-TCPP MOF的结构。因此，本方法对Pi 的检测具有良好的选择性。

进一步研究了Na+、K+、Ca2+、Mn2+、S2O32‒、SO32‒、HCO3‒和Ac‒等水体中常见离子对Pi 检测的影响。如图7B 所示，向检测体系中加入浓度为Pi 浓度10 倍的上述干扰物质后， Δr 未发生明显变化，表明本方法对Pi 的检测具有较强的抗干扰能力。

2.3 实际水样的检测

为了验证本方法在复杂水样中的检测性能，选取嘉陵江下游北碚段江水作为实际样本。嘉陵江拥有丰富的水资源，具有较高的社会经济价值，但由于其流经范围较广，难免存在多种污染物，包括重金属离子和阴离子（如Pi）等，因而对于嘉陵江江水水质的检测具有重要意义。采用本方法检测得到的Pi 浓度约为0.078 mg/L，钼酸铵分光光度法[44]检测得到的Pi 浓度约为0.080 mg/L（表2），两种方法的检测结果基本一致；同时，检测结果显示该江段的嘉陵江水也符合Ⅱ类水质标准[45]。上述结果表明本方法可用于复杂水体中Pi 的检测。

3 结论

制备了一种新型FA 探针Ce-TCPP MOF，实现了复杂水质环境中Pi 的检测。与现有的分析检测方法相比，本方法无需构建复杂的荧光探针便可实现对Pi 的灵敏检测，具有简便快捷和准确度高等优点；此外，由于Ce-TCPP MOF 自身具有较大体积及质量，无需额外加入FA 放大材料，因此实验操作简便，成本低。本研究为检测复杂水样中Pi 含量提供了一种新方法。