响应面法优化罂粟科植物叶片原生质体的制备条件

摘要： 【目的】系统优化罂粟科（Papaveraceae） 植物叶片原生质体提取的影响因素，建立其高效的原生质体提取体系。【方法】以花菱草（Eschscholtzia californica Cham.） 幼苗为罂粟科模式植物，通过单因素试验对影响原生质体产量和活力的预制液浓度、酶解液组成、酶解时间进行考察，借助响应面Box-Behnken 设计预测最佳提取方案，并将最佳方案在罂粟亚科（Papaveroideae）、角茴香亚科（Hypecooideae） 和荷包牡丹亚科（Fumarioideae）的代表性植物中进行验证。【结果】当预制液浓度为0.8 mol/L、酶解时间6 h、酶解液组成为1.5% 纤维素酶+0.4% 离析酶+0.3% 果胶酶时，花菱草原生质体的产量和活力最为理想，与响应面法的预测结果一致，能够成功获取罂粟科植物叶片的原生质体。【结论】本研究方法可实现罂粟科植物叶片原生质体的高效提取，为后续瞬时表达体系、亚细胞定位、单细胞测序等研究提供技术支撑。

关键词： 罂粟科；原生质体；酶解法；单因素试验；Box-Behnken 响应面法

中图分类号： Q949.748.1 文献标志码： A 文章编号： 1004–390X （2024） 02−0119−11

罂粟科（Papaveraceae） 包括罂粟亚科（Papaveroideae）、角茴香亚科（Hypecooideae） 和荷包牡丹亚科（Fumarioideae），在全球分布广泛[1]。该科植物荷包牡丹[Lamprocapnos spectabilis （L.）Fukuhara]、虞美人（Papaver rhoeas L.）、花菱草（Eschscholzia californica Cham.） 等因花朵艳丽通常被用作园艺观赏植物[2]；多数植物因特异性富集苄基异喹啉类生物碱而具有广泛的医疗作用，如吗啡具有很强的镇痛作用但具成瘾性而受到严格管控，延胡索乙素是生物碱中镇痛作用强但不具成瘾性的非麻醉性类镇痛药物[3]，小檗碱、血根碱等有较好的抗菌、消炎作用[4]。传统的罂粟科植物栽培育种生长周期长且成本高，无法满足市场对所需性状品种的需求。原生质体是去除细胞壁后均一稳定的感受态细胞，作为基础植物分子生物学研究和开发基因组编辑作物的重要材料，有助于实现从细胞水平上开展定向基因编辑或构建稳定的遗传转化体系，对于促进罂粟科植物的品种选育或改良具有重要意义。

目前，原生质体普遍应用于瞬时原生质体转染技术[5]、单细胞测序技术[6]、借助CRISPR/cas9介导的基因组编辑技术等研究领域[7-8]。在药用植物功能成分形成的分子机制研究方面，上述技术已应用于青天葵叶片、雷公藤悬浮细胞、秦艽叶、红花等研究中[9-12]，但技术体系有待进一步完善。在酶解法制备原生质体过程中，酶溶液组成和浓度以及酶解所需的pH 值、温度、时间等是影响原生质体分离和活性的最关键因素，预制液性质、稳渗剂种类和浓度、富集处理方法、剪切方法等也会影响原生质体的产量和活力[13-14]。由于表面蜡质较厚、不易浸于酶解液，罂粟科植物白屈菜（Chelidonium majus L.） 和博落回[Macleayacordata （Willd.） R. Br.] 叶片原生质体酶解效果不理想[15-17]，且该科其他植物原生质体提取及应用的研究报道也较少。响应面法结合单因素试验是一种有效开发、改进和优化试验的方法，Box-Behnken 设计可用于以最少的试验次数研究输入变量的个体效应和交互效应[18]，该方法已成功用于真菌、霉菌、藻类、桔梗等原生质体的制备条件优化[19-22]，但在罂粟科植物原生质体制备中尚未见报道。

花菱草为罂粟科多年生草本植物，具有生长周期短、株高适宜、易栽培等特点，已成功构建稳定的遗传转化体系[23]，被用作苄基异喹啉生物碱生物合成及转运机制研究的模式植物[24]。本研究利用酶解法提取花菱草幼苗原生质体，通过单因素试验和响应面法优化预制液浓度、酶解液组成和酶解时间，考察各变量间的相互作用对原生质体产量和活力的影响，从而获得原生质体提取数量和活力的最佳条件；再利用优化条件对部分罂粟亚科、角茴香亚科和荷包牡丹亚科植物进行原生质体提取验证，旨在为罂粟科植物后续原生质体融合、遗传转化体系构建、原生质体再生、单细胞测序技术等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试罂粟科植物包括3 亚科7 属9 种样本，分别为罂粟亚科罂粟属的虞美人，花菱草属的花菱草，白屈菜属的白屈菜，博落回属的博落回和小果博落回[M. microcarpa （Maxim.） Fedde]；角茴香亚科角茴香属的角茴香（Hypecoum erectum"Linn.）；荷包牡丹亚科荷包牡丹属的荷包牡丹，紫堇属的紫堇（Corydalis edulis Maxim.） 和延胡索（C. yanhusuo W.T. Wang）。博落回幼苗采集自湖南农业大学智能温室苗圃；花菱草、小果博落回和虞美人幼苗在组培室内用种子萌发获得；白屈菜、角茴香、紫堇、荷包牡丹和延胡索购自河南省禹州药材市场。