红莲型不育系绿3A原种商业化提纯繁殖技术研究

高胜从　吕加林　崔会会　刘明健　苏祥忠　朱昌栋　王传军　潘华　李涛　史昆

摘要：针对红莲型不育系绿3A在大规模繁殖时可能遇到的亲本种子纯度问题，创新地融合了“株系循环法”和“三系七圃法”进行提纯，并开展了后期繁殖的商业化配套技术研究，成功实现了年产亲本原原种10万kg的目标，不仅解决了提纯的技术难题，更为红莲型不育系的大规模商业化原种提纯繁殖提供了宝贵的参考。

关键词：红莲型；绿3A；提纯复壮；商业化；株系循环；动态平衡

Research on Commercial Purification and Propagation Techniques of Original Seeds of Honglian-Type Sterile Line Lv3A

GAO Shengcong，LYU Jialin，CUI Huihui，LIU Mingjian，SU Xiangzhong，

ZHU Changdong，WANG Chuanjun，PAN Hua，LI Tao，SHI Kun

（Anhui Win-All Hi-Tech Seed Co.，Ltd. /Key Laboratory of Hybrid Rice New Variety

Creation of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Hefei 230088）

20世纪70年代开始，中国农业科技人员相继成功实现“三系法”育种技术，促进了杂交水稻的大面积推广种植，取得了举世瞩目的成就。由朱英国院士团队育成的红莲型、野败型和包台型不育系被国际公认为杂交水稻三大细胞质雄性不育类型。近年来，红莲型杂交水稻在基础研究、应用研究和产业化等方面均有突破[1]，但仍然面临着亲本提纯制约大规模商业化推广的问题。

红莲型三系中籼稻不育系绿3A（原名9912A）是安徽省农业科学院绿色食品工程研究所于2002年育成，并在安徽适宜地区建立了相应的原原种、原种和良种繁育体系，但只具有年产2万kg的供种能力[2]。随着繁育世代的增加，特别是用种量急剧增加后，绿3A种子出现了育性不稳定现象，变异株和同形可育株等杂株比例超标，影响了其商业化应用。本文针对绿3A在大规模繁殖时亲本种子可能存在的纯度问题，对其采用多方法集成的不育性提纯及配套繁殖技术研究，成功地实现了亲本原原种年产10万kg。

1 绿3A提纯的方法与基地选择

1.1 提纯与检测的方法 绿3A（由安徽荃银种业科技有限公司提供，以下简称荃银科技公司），经多点田间鉴定纯度为97.5%～98.9%，进行绿优1号（绿3A/绿稻24）等品种试制，收获F1种子，纯度为90.0%～94.8%，因此，绿3A 亲本质量的提升迫在眉睫。“简易法”“株系循环法”和“三系七圃法”都是原种提纯的经典方法，经过多年摸索，本文采用了“株系循环法”和“三系七圃法”的融合，同时将“简易法”设为对照，并开展了后期繁殖的商业化配套技术研究[3]。采用NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程 SSR分子标记法》中的48个水稻SSR标记，对水稻样品进行DNA分析[4]。

1.2 基地的选择与播期安排 基地选择在江西省抚州市宜黄县，利用春繁季节（7月12-20日）高温时段，更有利于检测淘汰和选择高质量个体。春繁试验播种时间：不育系播种时间（A）：4月8日；保持系Ⅰ期与Ⅱ期播种时间分别为（B1）：4月11日、（B2）：4月15日；移栽时间：5月10日；抽穗时段：7月12-17日；收割时间：8月5日。

2 不同方法提纯的结果与比较

2.1 “三系七圃法”融合“株系循环法”实现对原种的精准提纯 利用大批量成对杂交株对，通过株行和株系淘汰、选择和鉴定，以动态平衡的方式，获得合格的混系株对种子，从而稳定质量（纯度），达到提纯繁殖目标。第1轮筛选：2019年建立选种圃，经过典型性状和育性检测，完成成对交123对（编码：绿3A19-n/绿3B19-n）。2020年正季种植株行圃选留29对。2021年种植株系圃，选留19对收获株系种子（分系），于海南种植鉴定质量（纯度），同年，抽穗前10d于分系田间取叶片进行室内真实性检测；见穗前在田间进行A、B套袋自交；花期分系测交绿3A/R9311，收获种子。第2轮筛选：2020年同步从第1轮株行圃和株系圃中选择优良单株，建立选种圃，进行“株系循环法”第2、3……N轮筛选，截至2023年已经完成3轮筛选。3轮提纯株系圃分系海南种植纯度鉴定情况具体见表1。

具体结果：第1轮筛选：完成成对交123对（编码：绿3A19-n/绿3B19-n）；株行圃当选比率（合格比例）23.5%；株系圃成对交当选比率（合格比例）15.4%；收获株系种子（分系）数量绿3A/绿3B：300kg/60kg，海南种植鉴定质量（纯度）99.95%/100%。

2021年分系DNA检测全部合格，田间检测不育株率100%，不育度99.83%，套袋自交结实0.17%；2022年种植测交种子，株系（19个混系）恢复度86%～94%，恢复株率达100%。持续用“株系循环法”进行第2轮、第3轮筛选，提纯原种，结果均较满意（表2）。

2.2 “简易法”繁殖原种，种子纯度不稳定 2019-2021年连续3年安排进行小面积的原种繁殖，绿3A和绿3B同步进行（表3）。技术程序：（1）在当年的亲本繁殖基地选择肥力水平均匀、条件好的繁殖田0.13～0.20hm2，严格按照单株种植繁殖；（2）在苗期、分蘖期、生殖生长始期、见穗期、抽穗期至种子收割前，多次进行严格除杂除劣，将一切可疑的植株全部除掉，混收种子，作为原种；（3）在实施的过程中，注意对单株的选择比较，严格把握亲本的典型性标准，严禁肥水、激素、农药和除草剂对性状的影响，规避人为误差[5]。通过技术人员持续的田间努力，混收种子质量（纯度）较繁殖前有显著提升，增幅较大，但是几代循环叠加，获得纯度99.8%以上的高质量亲本难度较大。

2.3 两种方法结果比较 前者方法提纯原种，能够精准获得高质量种子，可控制性较强，从成对交株对至株系（分系），直观掌握每一系的质量情况，方便淘汰不合格成对交，混合保留的株系种子作为大田繁殖用种种源；操作过程中，每一季涵盖成对交、株行和株系（分系）试验圃。相比较后者简便易于操作，但是无法收到高质量（纯度）原种，而且存在高世代个体出现“同质恢”转育结实的质量风险。

3 “三系七圃法”融合“株系循环法”需注意问题

3.1 选择比率波动 第1轮2019年成对交株行圃淘汰比率大于70%，分析原因是选种圃筛选时亲本种源的纯度较低，母本选种圃种植3200株，杂株达80株，比例达2.5%，杂株类型有早熟、晚熟、紫色稃尖、圆粒形、长粒形和同形可育株。第2轮、第3轮趋于稳定，每一阶段逐步淘汰和修整轻微变异的成对株对，株行圃和株系圃的选择比例大于50%，达到正常标准。

3.2 高温敏感株的自交结实 红莲型不育系属于配子体不育，花粉表现为二核期败育，败育花粉粒呈现出中空圆形，1%碘—碘化钾溶液下不着色，属圆败类型。几年来，在27.03°～27.43°N区域开展提纯研究，为筛选出高温转育株，通过分析该区域多年的气象资料，7月中下旬会有35～40℃高温天气，所以母本的抽穗扬花期安排在7月下旬，使得母本育性敏感期处于高温天气，母本就会出现不同程度的高温转育，转育个体俗称同形可育株，人工套袋自交试验，结实比例达1‰～2.5‰，而且自交后代为正常结实的早熟类型杂株。

3.3 选择方法由传统的限值选择改进为众数选择[6] 育种上常用优中选优方法进行系统选择，其田间淘汰率较高，操作时人为因素影响很大。利用“株系循环”良种繁育方法，以维持优良群体的稳定性为主要目标，掌握稳步求进的思路，可以使种子的质量和数量得到提高。在大田正常环境下选择植株，务必注重品种的典型性和群体性，只要不是杂株、劣株和病株都可以选用。

3.4 降低不育系用种代数 株系圃鉴定后的种子（原原种）混合后繁殖原种，将原种种子直接作为大田用种亲本用于制种生产，可以减少亲本中“同质恢”恢复基因的可育个体，随着 F1杂株及其分离后代的花粉进一步渗入到不育系和保持系中，产生大量的“同质恢”杂株，造成生物学混杂，导致恢复基因进一步扩散[7]。实践中，采取循环进行“选择—种植鉴定—选择”的提纯繁殖方式，持续获得原种，提供合格大田用种供制种生产环节使用，是一种可行的策略。

3.5 建立基础群体，用“株系循环法”逐步淘汰育种剩余变异[6] 根据单株选择理论，自花授粉作物只须进行一次单株鉴定选择，就可最大程度地除杂去劣，对生育期、株高等数量性状加以有效控制，就能选留到具有品种典型性和整齐一致的数个株行小区。工作人员在操作的过程中，首先将成对交进行株行比较鉴定试验，合格后的成对株行，再进行一季株系试验，就建立了株系循环基础群体。株系循环基础群体的株系数量一般不低于100个，以保证基因库的完整和稳定。依据该品种在一定的栽培条件和生态条件下自然形成的特性，田间选择时，保留群体中符合本品种典型性的多数或大多数个体，通过逐年的少量淘汰，有目的地提高有利基因频率。

4 商业化配套技术研究

4.1 增加专业技术力量，持续开展亲本育性研究 稳定在高温生态区域建立和发展原种提纯繁殖试验基地，利用高温气候环境诱导不育系中高温敏感株个体表现型显现，逐步淘汰不利基因型，稳步年产优良株系种650kg，分系海南种植鉴定检测，混系使用，繁殖用种纯度99.95%，制种用种纯度99.80%。

4.2 稳固适宜的生态繁殖基地 依托国家政策农业项目支撑，在江西省抚州市发展1～2个县、4～5个乡镇，建立起稳固的水稻亲本种子提纯繁殖基地，不育系年繁殖面积达133.3hm2。

4.3 采用“公司+基地+农户”的产业化模式 派驻专业技术人员全程督导；基地组建除杂专业队伍，人均除杂面积小于0.26hm2，保障繁殖质量；对农户进行繁殖过程技术监控和技术指导，确保环节合格。

4.4 繁殖过程中严格把关 抽穗授粉期安排在低温季节，以春繁、秋繁和海南春繁为主；实施空间隔离，杜绝用时间和距离隔离；及时清除田间再生苗；抽穗前组织人员去除明显杂株；花期重点拔除同形可育株，务必在散粉前完成，当天露杂当天去除；父本授粉完成立即低位割除，反复检查直至验收合格；收割母本前进行最后验收；收割机械仔细检查，防止机械混杂。

5 总结和展望

绿3A原种大规模商业化提纯繁殖遇到的问题，是很多红莲型杂交水稻同样面临的问题，也反映出当前我国杂交水稻研究重育种、轻提纯繁殖的现状。以产业化思维为引领，通过对亲本特征特性及前人相关研究进行深入了解，并脚踏实地去投入、去攻关，才能保质保量生产出合格种子，才能实现大规模产业化推广。当前，红莲型杂交稻在国内种植面积已达200多万hm2，并已逐步打开国外市场，在越南、老挝、孟加拉、非洲几内亚等国家种植均表现优异[8]。希望通过本文的研究，能够为大家提供一些借鉴，共同实现杂交水稻产业未来更大的发展。

参考文献

[1]黄文超，胡骏，朱仁山，李绍清，王坤，余金洪，李阳生，章志宏，朱英国．红莲型杂交水稻的研究与发展．中国科学：生命科学，2012，42（9）：689-698

[2]朱启升，杨前进．安徽红莲型细胞质的应用研究//中国科协，湖北省人民政府．2007中国科协年会专题论坛“红莲型杂交水稻学术专题研讨会”论文汇编．北京：中国科协，2007：179-182

[3]陆作楣，陶瑾，孙荣才．论我国杂交稻亲本繁育技术的演变．杂交水稻，1993（2）：1-3

[4]国家市场监督管理总局，中国国家标准化管理委员会．GB/T 39917—

2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测 稻．北京：中国标准出版社，2021

[5]张春庆．玉米水稻杂交种子生产技术．济南：山东科学技术出版社，2015

[6]陆作楣，陶瑾．论“株系循环法”．种子，1999（4）：3-5，8

[7]王际凤，陆作楣．恢复基因的渗入对红莲型不育系粤泰A纯度的影响．中国水稻科学，2007，21（5）：500-506

[8]朱仁山，余金洪，丁俊平，杜成波，李绍清，胡骏，黄文超，王坤，李阳生，杨代常，章志宏，朱英国．红莲型杂交水稻的研究与实践．杂交水稻，2010，25（S1）：12-16

（收稿日期：2024-03-01）