甘草多糖对鸡肉品质及其相关候选基因表达的影响

杨又兵　钱凯凤　卢小宁　娄然　刘永建　任旭鸽　游祥宾　李淦　徐志谦　雷莹　白俊艳

摘要：为探究甘草多糖对鸡肉品质的影响，设计不同水平的甘草多糖添加至日粮中，测定爱拔益加肉鸡的肉质性状和相关基因在肉质中的含量，以此来研究日粮中添加不同水平甘草多糖对其肉质的影响情况；并利用转录组测序技术（RNA-SEQ）分析了日粮中添加不同水平甘草多糖饲喂的肉鸡胸肌组织样品的转录组，从而筛选出能够调控肉质性状的关键基因，并利用实时荧光定量PCR技术进行验证。结果表明，在日粮中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖的试验组鸡的胸肌的肉质指标肉色、pH1、pH24、蒸煮损失和滴定损失与对照组均无显著差异（P>0.05），但发现随着日粮甘草多糖的增加，鸡的肉质指标有着不同程度的改善。在日粮中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了鸡胸肌中LPL基因、PPARγ基因、FABP3基因、CAST基因的相对表达量，在日粮中添加300、600 mg/kg甘草多糖降低了鸡胸肌中CAPN2基因的相对表达量；在日粮中添加900 mg/kg甘草多糖降低了LPL基因、PPARγ基因、FABP3基因、CAST基因的相对表达量。

关键词：甘草多糖；肉质性状；LPL基因；PPARγ基因；CAST基因

中图分类号：S831.5文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）09-0219-07

近年来，甘草多糖这种活性成分受到许多学者的关注。甘草多糖具有多种生物学功能，如可增强机体免疫力、促进生长发育、抗病毒等，在畜牧业上有广阔的应用前景。然而，目前国内外有关甘草多糖在鸡上的研究寥寥可数，且饲料中合适的添加量没有明确标准，作为饲料添加剂还不能广泛应用［1］。

肉质性能是影响养肉鸡生产经济效益的关键因素，但鸡肉的肉质性能很低，现阶段对肉鸡肉品质的研究主要还是在常规的肉品质上。目前，氨基酸和核苷酸是影响肉类及肉制品鲜味的2种重要因素，其中，肌苷酸又是影响核苷酸中鲜味最重要的成分。肌苷酸存在于肌肉中，与肉质鲜味的生成有密切关联［2］。一些研究表明，肌苷酸是影响畜禽肉质鲜味的重要物质，是衡量肉质鲜味的重要指标［3］。国内外学者的大量研究也表明，肌苷酸是影响肉质鲜味特性的关键性物质［4］。通过对肉鸡肌肉中常规肉品质和风味物质的研究，可为应激管理及应激性家禽生长代谢障碍的精准营养元素调控提供新的思路和方法。

对于甘草多糖免疫功能的研究较多，甘草多糖对动物肉质的影响研究较少，对鸡肉品质的影响鲜有研究，本试验设计不同水平的甘草多糖添加于日粮中，测定爱拔益加肉鸡的肉质性状和影响肉质相关基因的表达量，以此来研究日粮中添加不同水平的甘草多糖对肉质性状的影响情况，并利用RNA-SEQ分析了日粮中添加甘草多糖饲喂的肉鸡胸肌组织样品的转录组，从而筛选调控肉鸡肉质的关键基因，并利用实时荧光定量PCR技术进行验证，为爱拔益加肉鸡甘草多糖的最适添加量及影响肉质性状的基因提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

240羽1日龄健康爱拔益加肉鸡，采购于洛阳某市场；总RNA反转录试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、SYBR GreenⅡRNA染料、DL 2 000 bp maker、RNAiso Plus、固相Rnase清除剂、6×DNA Loading Buffer、2×Taq PCR MasterMix、Trziol、乙醇、异丙醇，均购自北京宝日医生物技术有限公司；冷冻高速离心机和Nano Drop 2000C超微量分光光度计，购于武汉塞维尔公司；凝胶成像仪和荧光定量PCR仪，均购于孚约生物科技（上海）有限公司。

1.2 引物设计与合成

参考NCBI数据库中爱拔益加肉鸡同源序列信息，采用Primer 5.0设计引物（表1），送往武汉生物工程有限公司合成。

1.3 试验方法

2021年6月在河南科技大学动物房进行试验，将240羽1日龄健康的爱拔益加肉鸡，采用抽签法随机分为4组，每组6个重复，每个重复10羽鸡。分别在基础日粮中添加0、300、600、900 mg/kg甘草多糖依次设为对照组，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的饲粮，试验期42 d。

1.3.1 样品采集

试验鸡饲养至42日龄结束，每重复随机选2羽鸡，宰前禁食12 h，并提供足够的饮用水。屠宰时采用手术剪剪开体腔，并缓缓分离出左侧胸肌，一部分胸肌置于4 ℃用于测定肉质性状（肉色、pH值、蒸煮损失、滴水损失），一部分置于液氮中冷冻保存，后保存于-80 ℃超低温冰箱。

1.3.2 肉质性能的测定

1.3.2.1 肉色的测定 取各组屠宰鸡的胸肌，采用比色板法，将肉样与标准肉色谱对照、评分。避免在阳光直射下或在室内阴暗处评定。评分标准为 1～7分，两级间允许评0.5分。每份样品测3个点，取其平均值。

1.3.2.2 肌肉pH值的测定 拿各组宰杀后停止呼吸后45 min已经采集好的胸肌样品，采用酸度计测定pH值，记作pH1；在4 ℃条件下，冷却保存24 h后测定pH值，记作pH24。每组测定3次，取其平均值。

1.3.2.3 蒸煮损失的测定 取各组已采集好的胸肌样品，去除肌外膜、脂肪后，称重Z1（30～50 g）。将肉样采用细绳绑住悬空吊于80 ℃水浴锅中保持30 min，细线另一端用透明胶带固定。30 min 后将肉块取出，在阴凉通风环境下放置 20 min，称重Z2。

蒸煮损失=（Z1-Z2）/Z1。

1.3.2.4 滴水损失的测定 取各组胸肌样品，去除肌外膜、脂肪后，称重D1（10～20 g）。放入滴水损失测定管置于0～4 ℃冰箱内24 h。24 h后，采用电子天平称取各肉块重D2，记录数据并计算。

滴水损失=（D1-D2）/D1。

1.3.3 总RNA提取

提取RNA，于超净工作台内操作，提前采用紫外光灯照射超净工作台约30 min，再使用1%固相RNase清除剂喷洒灭菌，采用吸水纸擦干，采用Trizol试剂盒提取胸肌组织总RNA，稀释完成后，取1 μL放至超微量分光光度计中检测RNA浓度，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量。

1.3.4 总RNA反转录cDNA

使用反转录试剂盒合成cDNA第1步反应条件是：总RNA 1 μL、gDNA Eraser 1 μL、5gDNA Eraser Buffer 2 μL，补RNase Free dH2O至10 μL，42 ℃ 2 min。第2步的反应条件是：步骤1的反应液 10 μL、RT Primer Mix 1 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer（for Real Time） 4 μL、RNase Free dH2O 4 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，产物置于-20 ℃保存。

1.3.5 实时荧光定量 PCR

荧光定量的每个样品均需要设置平行重复，该试验设置3次重复，保证每次重复所有条件均一致。qPCR反应所需试剂，由表2可知，荧光定量PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40个循环；熔解曲线为95 ℃ 15 s，60 ℃  15 s，95 ℃ 15 s。

1.3.6 荧光定量结果计算分析

采用2-ΔΔCT 法计算鸡肉质相关候选基因的相对表达量，以GAPDH基因作为内参进行标准化，所得试验数据运用软件SPSS 25进行分析，并利用软件Graphpad Prism 9.3作图。

2 结果与分析

2.1 不同甘草多糖水平对爱益拔加鸡肉品质的影响

由表3可知，在日粮中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖的试验组鸡的胸肌肉质指标肉色、pH1、pH24、蒸煮损失和滴定损失与对照组均无显著差异（P>0.05），但观察发现随着日粮甘草多糖的增加，鸡的肉质指标有着不同程度的改善。

2.2 总RNA的质量检测

经Nano Drop 2 000 C超微量分光光度计检测，提取的总RNA浓度均在2.0～3.5 μg/μL，D260 nm/280 nm≥1.9，D260 nm/230 nm均约为2.2，表明肉鸡总RNA无明显降解，无明显的蛋白质、DNA及酚等其他物质的污染；1%琼脂糖凝胶检测，由图1可知，RNA条带清晰明亮，表明所提取的总RNA质量良好。综上，提取的肉鸡总RNA可用于后续试验。

2.3 荧光定量 PCR 熔解曲线

由图2可知，其中，A、B、C、D、E、F、G分别对应GAPDH基因、LPL、PPARγ、FABP3、CAPN2、CAST和UCP3基因的熔解曲线，发现目的基因及内参基因的扩增曲线整体平滑，且出现了“S”形的曲线， 比较符合预期。扩增曲线出现的曲线拐点较为明显，且平台期的曲线稳定平滑，无上升趋势。通过观察熔解曲线上的拐点，发现目的基因和内参基因的扩增产物Tm值均一，熔解曲线上仅出现1个明显的单一峰，表明在PCR过程中，所采集的信号均来自于特异性扩增产物。

2.4 鸡肉质相关候选基因表达规律分析

2.4.1 LPL基因 mRNA 的表达分析

由图3可知， 日粮中添加300、 600 mg/kg甘草多糖均增加了鸡胸肌中LPL基因相对表达量。日粮中添加600、900 mg/kg甘草多糖LPL基因的相对表达水平差异显著（P<0.05）。随着日粮中甘草多糖量的增加，LPL基因的相对表达量先增再降，当添加量为 600 mg/kg 时，基因相对表达水平最高。

2.4.2 PPARγ基因mRNA的表达分析

由图4可知，日粮中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了鸡胸肌中PPARγ基因相对表达量。日粮中添加600、900 mg/kg甘草多糖PPARγ基因的相对表达水平差异显著（P<0.05）。随着日粮中甘草多糖量的增加，PPARγ基因的相对表达量先增加再降低，当添加量为600 mg/kg时，基因相对表达水平最高。

2.4.3 FABP3基因mRNA的表达分析

由图5可知，日粮中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖增加了鸡胸肌中FABP3基因相对表达量，随着日粮中甘草多糖量的增加，FABP3基因的相对表达量先增加后降低。日粮中添加0与600 mg/kg甘草多糖FABP3基因的相对表达水平差异显著（P<0.05）。添加量为600 mg/kg时，FABP3基因表达水平相对最高。

2.4.4 CAPN2基因mRNA的表达分析

由图6可知，日粮中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖均降低了鸡胸肌中CAPN2基因相对表达量，随着日粮中甘草多糖量的增加，CAPN2基因的相对表达量先降低再增加。日粮中添加0、600 mg/kg 甘草多糖CAPN2基因的相对表达水平差异显著（P<0.05）。日粮中添加甘草多糖可降低基因的表达，当添加量为600 mg/kg时，CAPN2基因表达水平相对最低。

2.4.5 CAST基因mRNA的表达分析

由图7可知，日粮中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖增加了鸡胸肌中CAST基因相对表达量，随着日粮中甘草多糖量的增加，CAST基因的相对表达量先增加后降低。日粮中添加0与600 mg/kg甘草多糖CAST基因的相对表达水平差异显著（P<0.05），当添加量为600 mg/kg时基因表达水平相对最高。

2.4.6 UCP3基因mRNA的表达分析

由图8可知，日粮中添加300、600、900 mg/kg甘草多糖降低了鸡胸肌中UCP3基因相对表达量，随着日粮中甘草多糖量的增加，UCP3基因的相对表达量也在降低。日粮中添加甘草多糖可降低UCP3基因的表达量，随着甘草多糖量的增加，基因表达水平先降低后升高。日粮中添加0与600 mg/kg甘草多糖UCP3基因的相对表达水平差异显著（P<0.05），在添加量600 mg/kg时，基因表达水平达最低。

3 讨论

3.1 肉鸡LPL基因的表达规律分析

脂蛋白酯酶（LPL）是脂肪代谢的关键酶，它能够催化和水解甘油三酯，生成脂肪酸和甘油，提供给机体的各组织利用和储存［5］。Griffin等的研究表明，肉鸡LPL基因的表达影响鸡脂肪代谢，认为可将LPL基因作为脂肪调节的候选基因［6］。为进一步研究两者间的相关性，一些研究者对其做了深入研究，王晶研究发现，随日龄增长，广西三黄鸡和AA鸡胸/腿肌的LPL酶活性逐渐升高，且肌内脂肪含量也随之增加，两者间呈正相关［7］。王斌等研究同样发现，淮南麻黄鸡的胸肌和腿肌脂肪含量与LPL基因表达量呈显著正相关［8-9］

本试验在日粮中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了鸡胸肌中LPL基因相对表达量，900 mg/kg降低，说明在一定范围内甘草多糖添加量与LPL基因表达水平呈正相关，与前人研究结果一致。

3.2 肉鸡PPARγ基因的表达规律分析

PPARs能够调控许多细胞内的代谢过程，在已发现的3种亚型中，PPARγ与脂肪细胞的增殖分化有密切的联系。杜琛等通过构建绒山羊shRNA-PPARγ慢病毒载体试验，研究发现沉默PPARγ基因后，脂肪细胞分化受到显著影响［10］。白晓苏等研究同样发现，在3T3-L1脂肪细胞分化过程中PPARγ表达增加［11］。本试验在日粮中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了鸡胸肌中PPARγ基因相对表达量，900 mg/kg降低，说明在一定范围内甘草多糖添加量与PPARγ基因表达水平呈正相关。

3.3 肉鸡FABP3基因的表达规律分析

脂肪酸结合蛋白（FABPs）主要存在于动物细胞质中，它在动物体内脂肪的合成与降解中扮演重要角色，在脂肪转运过程中发挥着重要作用［12］。此外，畜禽FABP3基因还能通过影响肌内脂肪的含量，进而影响肌肉嫩度和风味水平，是影响肉质性状的关键候选基因［13］。本试验在日粮中添加300、600 mg/kg甘草多糖均增加了鸡胸肌中FABP3基因相对表达量，900 mg/kg降低说明在一定范围内甘草多糖添加量与FABP3基因表达水平呈正相关。

3.4 肉鸡CAPN2基因的表达规律分析

CAPN1和CAPN2的表达量均与肌原纤维水解有着密切联系，在畜禽肉的嫩化发挥着关键性作用［14］。目前，国内外有关CAPN2基因的研究还较少。本试验在日粮中添加300、600、900 mg/kg水平的甘草多糖可降低鸡胸肌中CAPN2基因相对表达量，甘草多糖添加量与CAPN2基因表达水平呈负相关。

3.5 肉鸡CAST基因的表达规律分析

CAST基因不仅调控肌肉中蛋白质新陈代谢过程，还影响畜禽肉品质的嫩度，是作为影响肉质性状的关键候选基因［15］。目前，CAST基因作为嫩度候选基因主要在猪、牛、羊上研究较多，而在鸡上的研究寥寥可数。本试验在日粮中添加300、600 mg/kg 甘草多糖均增加了鸡胸肌中CAST基因相对表达量，900 mg/kg降低，说明在一定范围内甘草多糖添加量与CAST基因表达水平呈正相关。

3.6 肉鸡UCP3基因的表达规律分析

张继等研究UCP2和UCP3基因表达对猪肉质的影响中发现，在猪的背最长肌和腰大肌中，UCP2表达量的增加不利于肌肉内脂肪沉积，降低肉的品质，UCP3对肉质的关联则与UCP2相反［16-17］。由此推测，肉鸡UCP3基因可能也影响着肉鸡的脂肪代谢，可能UCP3表达量的增加或减少影响鸡肉的肌内脂肪沉积，并影响鸡的肉品质。本试验从研究甘草多糖对肉鸡肉质的影响，结合研究甘草多糖对肉鸡肉质相关基因UCP3基因表达的影响，来验证和推测甘草多糖对肉鸡作用、肉鸡UCP3基因及肉品质的相关性，结合甘草多糖对肉质影响结果和甘草多糖对肉鸡UCP3基因的表达影响结果，观察推测甘草多糖可能影响鸡的脂肪代谢。

4 结论

本试验通过在日粮中分别添加0、300、600、900 mg/kg 甘草多糖，测定爱拔益加肉鸡的肉质指标肉色、pH1、pH24、蒸煮损失和滴定损失及肉质相关基因表达量，通过对比4种甘草多糖水平组的肉质指标，得到4种甘草多糖水平组的差异均不显著，但以600 mg/kg甘草多糖水平的肉质指标最好。通过对比4种甘草多糖水平组的基因表达量，得到 600 mg/kg 甘草多糖组的LPL、PPARγ、FABP3和CAST基因表达量显著高于对照组（P<0.01）；600 mg/kg 甘草多糖组的CAPN2、UCP3基因表达量显著低于对照组（P<0.01）。600 mg/kg甘草多糖对鸡肉质指标和肉质相关基因表达的影响最显著。通过向日粮中添加不同水平的甘草多糖，探究爱拔益加肉鸡肉质性状和相关基因的表达情况，期望为以后肉鸡肉品质和候选基因的研究提供理论基础。

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收稿日期：2023-05-09

基金项目：河南省科技攻关项目（编号：222102110477）；河南省高校国家级大学生创新创业训练计划重点支持领域项目（编号：202210464064）。

作者简介：杨又兵（1977—），男，湖北黄冈人，博士，副教授，研究方向为动物遗传育种和动物遗传资源保护与开发利用。E-mail：yangyoubing@sina.com。

通信作者：白俊艳，博士，教授，研究方向为动物分子育种。E-mail：junyanbai@163.com。