羊布鲁氏菌的实验室诊断及综合防治措施实施探讨

范冬梅 韦丹标 阿依努尔·肉孜

DOI： 10.3969/j.issn.1003-1650.2024.18.035

布鲁氏杆菌病属于人畜共患传染性疾病的范畴，不仅具有很强的传染能力，而且传播方式多种多样，特别是在羊养殖管理过程中，一旦感染该种疾病将会对羊的健康生长造成影响，尤其是会对繁殖母羊的生产造成严重危害，严重影响到养殖场的经济效益。近年来，随着羊养殖规模的逐渐扩大，基层地区的很多养殖户在对外引种过程中没有执行严格的检疫规程，存在侥幸心理，导致布鲁氏杆菌从外地引入的风险极大增强，对本地区羊养殖业的健康发展构成严重危害。为切实保障羊布鲁氏杆菌病的防控成效和防治质量，在养殖管理期间就需要提高重视程度，注重加强布鲁氏杆菌病的科学诊断，通过科学的病原分离鉴定，及时确定病情，然后实施综合防治措施，将布鲁氏杆菌病的发生流行率降低到最低程度。本文主要结合实际工作经验，在对羊布鲁氏杆菌病发病现状进行探讨的基础上，明确了该种疾病的流行特点危害以及诊断方法，并提出了综合防治措施，希望对更好地提高不仅是杆菌病的防控成效有一定帮助。

一、流行病学

1、病原学

羊布鲁氏杆菌病简称羊布病，是由布鲁氏杆菌引起的人畜共患慢性传染病。病原菌布鲁氏杆菌属于细菌界，革兰氏染色阴性，为需氧型细菌，不具备芽孢和荚膜结构，在显微镜下观察，布鲁氏杆菌通常呈球杆状，且在细胞内可见。布鲁氏杆菌对环境的抵抗力较强，能在土壤、水中存活数月，在干燥土壤中的存活时间约为1个月。在寒冷的环境中，其存活时间可长达6个月。该菌对高温、消毒剂和光照的抵抗力相对较弱。根据布鲁氏杆菌的生物学特性和致病性进行的可以将其划分成羊种布鲁氏杆菌、牛种布鲁氏杆菌、猪种布鲁氏杆菌、狗种布鲁氏杆菌等几种。

2、致病机理

布鲁氏杆菌主要通过接触感染动物的血液、体液、分泌物或排泄物而传播。在养殖环境中由于羊与带菌动物的未经处理的流产胎儿、粪便、尿液等接触，使得布鲁氏杆菌得以传播。布鲁氏杆菌进入羊体后，依靠其表面抗原和毒素，逃避宿主免疫系统的监视和攻击，然后通过血液循环和淋巴系统传播到全身多个组织和器官，但主要侵害生殖系统和关节。通常情况下布鲁氏杆菌通过表面的侵袭素和黏附素，与宿主细胞表面的受体结合，从而侵入宿主细胞。并且布鲁氏杆菌能有效逃避宿主的天然免疫和适应性免疫应答，细菌在宿主体内存在时，能通过多种通道分泌抑制炎症反应因子等多种机制抑制巨噬细胞的吞噬作用和杀菌能力，细菌产生的内毒素和外毒素对宿主细胞具有破坏作用，导致组织损伤和炎症反应。一般情况下，布鲁氏杆菌呈现慢性感染，导致羊的生产力下降、繁殖障碍和生长迟缓。在慢性感染过程中，细菌在宿主体内持续存在，与宿主免疫系统形成平衡，使得感染难以根除。

3、流行特点

羊布鲁氏杆菌病的主要传染源是病羊和带菌羊，布鲁氏杆菌可以在羊的皮毛、粪便、分泌物、肌肉组织以及羊水、流产胎儿和精液中找到。健康羊群通过接触或食用被病原污染的饮用水和饲料，或者通过与病羊的直接接触，或接触被病原污染的物品而感染。在空气中布鲁氏杆菌通过呼吸道进入健康羊体内，此外配种或人工授精过程中，病原也可以通过生殖道传播。除了羊之外牛、猪、鹿、马、犬等均为布鲁氏杆菌的易感宿主。其中羊对该病的易感性最高，尤其是性成熟的母羊，其易感性通常显著高于公羊，公羊可能成为携带病原菌或隐性发病的宿主。从流行季节来看布鲁氏菌病没有典型的季节性，一年四季都有可能发生。不过在羊养殖主产区可能因气候、饲养管理方式等因素呈现出地方性的季节性流行趋势。从布鲁氏杆菌病的流行原因角度来看，不良的饲养管理和卫生条件密度过大、营养不良、圈舍卫生差等都可能促进病原的传播。生物媒介虽然不是主要传播途径，但环境污染较为严重，环境当中存在大量的吸血昆虫如蚊子、蜱等也可能参与传播布鲁氏杆菌。此外，饲养管理人员个人防护不足，频繁接触病畜或其排泄物，也可能导致病原传播。

二、临床症状

羊布鲁氏杆菌病的潜伏期长短不一，一般为2周～6个月，但有时也可能长达1年。发病期间母羊流产是该类疾病最典型的临床症状之一。感染布氏杆菌的妊娠母羊通常在怀孕的第3～4个月会出现流产现象。流产前患病羊可能出现食欲减退、饮水量增加、精神萎靡不振等症状，从阴道中分泌出淡黄色液体。流产的胎儿可能是死胎或呈现僵尸胎现象，即出生后立即死亡但外观无明显异常的胎儿。胎衣可能呈现黄色胶冻状浸润，胎衣显著增厚，并存在散在出血点。配种公羊可能出现睾丸炎，睾丸坚硬、硬化。羔羊和育成羊在少数情况下也会出现败血症症状，黏膜和胶膜上出现大量出血点，皮下和肌肉组织出现浆液性浸润，全身淋巴结肿大等。

三、病理学变化

病原菌首先感染羊的生殖系统，引起生殖器官的炎症。初期感染部位的黏膜充血、水肿，伴有黏液性或脓性分泌物。随着病程的发展，炎症逐渐加重，组织坏死，形成溃疡。后期病变部位的纤维组织增生，导致生殖器官变形，功能减退。关节受到病原入侵之后，初期关节腔内出现浆液性或浆液纤维素性炎症，伴有发热、疼痛等症状。随后关节炎症加重，关节软骨和骨组织受到破坏，导致关节肿胀、疼痛加剧，活动受限。最终关节僵硬，功能丧失。同时布鲁氏杆菌还会对肝脏脾脏淋巴结造成严重危害，症状较轻时肝、脾、淋巴结肿大，质地变硬。病程加重之后肝、脾、淋巴结实质细胞坏死，形成溃疡。后期病变部位的纤维组织增生，使肝、脾、淋巴结变形，功能减退。有些患病羊在发病期间还会表现出神经系统病变，神经组织充血、水肿，伴有浆液性或脓性分泌物，随后炎症逐渐加重，神经组织坏死，形成溃疡，有时在病变部位还能够看到纤维组织增生，导致神经组织受压、变形，功能减退。

四、实验室诊断

1、病原分离培养

对于细菌性疾病，病原分离培养是诊断该类疾病的金标准，但由于布鲁氏杆菌具有特殊的侵染环境，主要在动物细胞当中繁殖生长，因此细菌分离培养难度相对较大，尤其是对于慢性布鲁氏杆菌病几乎无效，通常不能够从病料当中分离到致病源。一般细菌分离培养主要用于羊种布鲁氏杆菌病和猪种布鲁氏菌病的鉴别诊断，很少用于其他种布鲁氏杆菌病的鉴别。在分离培养过程中，布鲁氏杆菌的菌落生长困难并且生长缓慢。一般布鲁氏杆菌的典型菌落为圆形或类圆形，直径1～2mm，刚分离的菌落呈灰白色或乳白色，随着培养时间的延长，菌落颜色逐渐加深，变为淡黄色或黄褐色，菌落表面光滑，边缘规则，质地柔软，黏附性强，不易乳化，半透明或不透明，属于需氧菌，适宜生长温度为37℃，pH为6.6～7.4。在血琼脂平板上布鲁氏杆菌菌落呈灰白色或乳白色，周围有轻度β-溶血环。并且在进行细菌分离培养过程中需要在生物安全二级实验室（BSL-2）中进行。

2、染色镜检

布鲁氏杆菌在进行染色镜检过程中，常规的染色剂如革兰氏染色剂不能够很好地将其着色，在显微镜下能够观察到革兰氏阴性染色的布鲁氏杆菌，但是染色不明显，尤其是细胞壁和荚膜染色不明显。瑞士染色剂能够更加清楚地显示布鲁氏杆菌的荚膜，染色之后细胞呈淡红色，荚膜被染成深蓝色，包围着细胞。

3、血清诊断

①虎红平板凝集试验

检测原理是将待检血清滴加到含有虎红细胞和布鲁氏杆菌抗原的平板上，如果血清中存在布鲁氏杆菌抗体，抗体会与抗原结合，导致虎红细胞凝集。操作过程中取一个无菌培养皿，在皿底平铺一层虎红细胞悬液。将待检血清按一定稀释度（如1∶20、1∶40、1∶80）滴加到虎红细胞悬液上，每个稀释度滴加一滴，培养皿置于37℃孵育18～24h。完全凝集，形成明显的小颗粒，培养皿底部呈均匀红色表示为阳性，无明显凝集，呈均匀分布状态，培养皿底部呈鲜红色表示为阴性。部分凝集形成小团块或细小的悬浮颗粒，可能存在假阳性的血清凝集结果，需要进一步稀释血清进行复查。

②试管凝集试验

试管凝集试验原理是将待检血清与已知浓度的布鲁氏杆菌抗原混合，如果血清中存在布鲁氏杆菌抗体，抗体会与抗原结合，导致抗原凝集沉淀。取一个试管，加入待检血清和一定量的布鲁氏杆菌抗原，将试管置于37℃水浴中孵育2h，取出试管，观察结果。试管底部出现明显的凝集沉淀为阳性，底部无明显凝集沉淀判定为阴性，底部出现细小的凝集物或浑浊表示可疑，需要进一步进行检测。

③补体结合试验

操作过程中采集受检动物的血清，使用已知的布鲁氏杆菌抗原，使用新鲜的小白鼠血清作为补体来源，将血清、抗原、补体和生理盐水按一定比例混合，孵育一定时间，然后加入溶血系统（红细胞和抗红细胞血清），观察溶血现象。血清中含有针对布鲁氏杆菌抗原的补体结合抗体，溶血系统不发生溶血，补体结合滴度≥1∶8为阳性，血清中不含有针对布鲁氏杆菌抗原的补体结合抗体，溶血系统发生溶血，补体结合滴度<1∶8为阴性。

五、疫情处置

在进行羊布鲁氏杆菌病疫情处置过程中，一定要严格执行国家法律法规，详细按照《中华人民共和国传染病防治法》《中华人民共和国动物防疫法》《布鲁氏杆菌病防治技术规范》《布鲁氏杆菌病疫情应急预案》的相关要求建成议程处置。任何单位和个人发现疑似或确诊布病疫情时，应立即向当地兽医主管部门和动物卫生监督机构报告，通过严格的诊断确定疫情之后根据疫情严重程度和扩散情况，划定疫点、疫区和受威胁区，对疫点进行隔离，禁止动物及其产品移动，防止疫情扩散，对检测为阳性的羊群立即进行扑杀淘汰处理，患病动物接触的环境物品进行消毒，推荐使用2%的氢氧化钠溶液，2%的复合酚溶液，10%的生石灰乳进行交替消毒。病羊的流产物和死畜需要进行深埋处理，污染的环境则可用20%的漂白粉或10%的石灰乳进行消毒。病畜的乳制品需煮沸消毒，皮毛则可用过氧乙烷熏蒸消毒，并放置3个月以上再运出疫区。同时，应将病羊和健康羊只分群分区放牧，病羊用过的牧场需经过3个月的自然净化后才能供健康羊只使用。在封锁隔离期间，对受到威胁地区的养殖场应该进行紧急免疫接种，选择使用国家推荐的M5株或者S9株疫苗进行免疫接种，每只羊使用1mL，保护期三年。持续加强疫区内的流行病学调查，发现疑似患病病例之后应该及时扑杀处理，逐步对羊群做出有效的净化。发病养殖场的检测为阴性的羊群，应该单独隔离，不能用于配种，应该立即进行育肥，及时淘汰。通过多年有效净化处理，确保疫区内的养殖场能够逐步达到地区和国家级净化标准，并在净化处理过程中对疫区内外进行监测，评估疫情控制效果。同时，对从事布病监测、防治工作人员进行专业培训，普及布病防治知识，提高公众和养殖户的自我防护意识和能力，对每次疫情处置完毕后进行总结，评估效果，不断完善疫情处置方案。

六、预防措施

为了有效预防羊布病，引导养殖户坚持自繁自养，尽量不引进带菌的羊只，防止引入布病，若必须引种，一定要按照相关技术规程开展针对性的引种检查，防范像布鲁氏杆菌病这类传染性疾病传入到养殖场内部，保证羊群健康安全。一般在引种检疫过程中，应该严格执行国家法律法规，严格遵守《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国进出境动植物检疫法》《布鲁氏菌病防治技术规范》《动物疫情报告和通报办法》。在引种前对来源地进行风险评估，了解当地的布病疫情确保从无疫病地区引种，然后向当地兽医主管部门申请引种，提交包括引种地布病疫情、引种场地的兽医卫生状况等材料，并对羊只进行健康检查，包括布病在内的相关疫病检测，必须由官方认可的兽医机构进行。到达养殖场的引种羊只应隔离观察至少45天，其间要进行定期健康监测，确保没有携带布病，并在隔离观察期间，根据所在地区的疫病流行趋势进行疫苗免疫接种，以防止疫病传播。经过隔离观察和健康检查，确认羊只未感染布病后，才能够混合养殖。日常也需要保持羊舍清洁干燥，通风良好，减少病原菌的生存和传播条件。定期对羊舍、用具等进行消毒，使用有效的消毒剂如10%的氢氧化钠溶液、5%的过氧乙酸溶液和2%的福尔马林溶液等，常规消毒每周进行一次，大清理大消毒每季度进行一次，疫情发生之后，应该坚持每天消毒1～2次，持续14天。对于受到布鲁氏杆菌病威胁的养殖场可以采用疫苗接种的方式提高羊只的免疫力，减少布病的发生，未受到布鲁氏杆菌病威胁的养殖场，通常不采用疫苗免疫接种。另外为了防范布鲁氏杆菌由深处向人类群体传播蔓延，要求养殖户在日常养殖管理，尤其是疫情处置过程中，一定要注重做好个人防护。

综上所述，羊布鲁氏杆菌病是一种危害较为严重的接触性细菌性传染性疾病，该类疾病的发生流行会对羊的生长发育以及一个地区的畜牧养殖安全构成严重的危害。由于布鲁氏杆菌存在多种类型，再加上养殖管理人员对布鲁氏杆菌病的危害认知不足，当出现疫情之后不能够第一时间做出有效的诊断，不能够立即将病情上报当地的畜牧兽医部门，最终造成疫情逐渐扩大蔓延。为更好降低羊布鲁氏杆菌病的发生流行率，就需要加快布鲁氏杆菌病分离诊断方法的深度攻关，要明确不同诊断方法的优缺点，规范诊断操作，确保在短时间内能够判定病原感染类型。另外在今后的布鲁氏杆菌病防控期间，也需要加强对该种疾病诊断技术的深度研究，加快快速准确诊断技术的创新和改革，为该类疾病的防治和净化奠定坚实基础，最终推动羊养殖业的现代化发展。

（作者单位：1.061001河北省沧州市动物疫病预防控制中心;2.530817广西大化瑶族自治县板升乡水产畜牧兽医站;3.843200新疆阿克苏地区动物疫病控制诊断中心）