烟碱转运候选基因NtABCG6L生物信息学及表达特征分析

龙本山 莫泽君 张静瑶 彭丽沙 段丽丽 罗家骏 刘仁祥

摘要：为预测前期筛选到的可能影响烟草烟碱含量的NtABCC6L基因是否具有转运烟碱功能，本研究采用生物信息学方法对NtABCC6L基因的启动子序列以及编码蛋白的理化性质和结构进行分析，利用软件对烟碱与NtABCC6L蛋白进行分子对接，并分别在烟株打顶0、7、14、21 d取根、茎、叶测定烟碱含量和NtABCC6L基因的相对表达量，以分析NtABCC6L基因表达量与烟碱转运效率的关系。结果表明．NtBCC6L基因共编码729个氨基酸；NtABCC6L蛋白分子量为81.29 kDa，理论pl值为8.97，含有ABC_transporter-like_ATP-bd、AB-CC_dom、ABC_2trans结构域，二级结构主要由a-螺旋和无规则卷曲组成，存在跨膜结构，主要定位在细胞膜上，预测NtABCC6L是一个跨膜转运蛋白。NtABCC6L蛋白与烟碱可以通过氢键结合，结合能为-2.95。Nt-ABCC6L基因主要在烟草根部表达，打顶14 d表达量最高，其表达量与烟碱转运系数呈显著正相关关系，初步推测NtABCC6L基因参与了烟碱的转运过程。本研究结果可为进一步采用基因编辑技术明确其功能提供依据。

关键词：烟草；NtABCC6L基因；生物信息学分析；烟碱转运；基因表达

中图分类号：S572：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）04-0020-09

烟草（NicotiarLa tabacum L.）是我国重要的经济作物，烟碱是其植株体内一种特有的生物碱，是人们吸食烟草的主要物质。烟碱是一种在根系合成、由木质部运输至叶片积累的次生代谢产物，其转运是一个非常复杂的过程，不仅要从根向叶进行长距离运输，还需要借助大量的转运蛋白，跨越根细胞质基质、根质外体、木质部汁液、叶质外体、叶细胞质基质等多个组织，实现胞内和胞间运输。如黄连素是一种异喹啉生物碱，Shitan等通过RT-PCR克隆到了编码黄连素转运蛋白的基因CjMDR，在非洲爪蟾卵母细胞中表达CjMDRJ后，发现该蛋白能将黄连素由胞外转运至胞内：NtNUPI主要负责将细胞质外体的烟碱转运至胞质内，从而维持根部烟碱平衡：NtMATE1和NtMATE2编码的蛋白可以把烟碱转运至中央液泡中。烟碱转运还受转录因子协调调控。有研究表明，NtMYC2a可以与MYC相关转录因子bHLH的同源物形成功能复合体来调控烟碱的转运，起到一个“总开关”的作用。另外，Mo等利用蛋白质组学和共表达网络分析揭示出中枢蛋白在烟碱转运过程中发挥着重要作用，并筛选到一些可能与烟碱转运相关的蛋白（GST，ABCE2，ABCF1和SLY1）。但这些蛋白在烟碱转运过程中的功能并未得到进一步验证，还需进行深入挖掘和验证研究。

ABC转运蛋白是一类功能多样的跨膜转运蛋白，可直接利用水解ATP供能，实现对植物次生代谢物的跨膜转运。ABC转运蛋白结构主要包含2个部分，分别是水解ATP的核苷酸结合结构域（ nucleotide binding domain，NBD）和提供转运途径的含有多个a-螺旋的跨膜结构域（transmembrane doman，TMD）。NBD位于膜的胞质面，可以结合底物并水解ATP产生能量为转运底物提供动力；TMD则是利用NBD释放的能量选择底物并进行跨膜运输，两者相辅相成共同实现了ABC转运蛋白的转运功能。根据蛋白质结构域的不同，可以将大多数真核生物的ABC转运蛋白分为8个主要亚家族（A-H），其中ABCG转运蛋白是ABC家族中成员数量最多的亚家族。根据结构域数目的不同，植物ABCG蛋白又分为WBC和PDR两个亚家族，其中，WBC为半分子ABC蛋白，必须与自身或者其他本家族的成员形成同源或异源二聚体才能发挥转运功能：而PDR为全分子ABC蛋白，可直接发挥转运功能。ABCG转运蛋白还有结构域类型为NBD-TMD的反向序列，可区别于其他亚家族。ABCG转运蛋白是植物ABC转运蛋白研究的热点家族，在次生代谢物如萜类物质、植物生长调节物和金属离子运输中发挥着重要作用。研究发现，丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）SmABCGl具有从胞内向胞外转运丹参酮ⅡA的作用；梅花PmABCG9能转运苯甲醇；桃PpABCG14可以转运细胞分裂素；AtABCG30/40具有转运脱落酸（ABA）的作用；皱叶烟草NpPDRl参与香紫苏醇的转运过程；忽地笑（Lycoris aurea）LaABCG3和LaABCG5基因受茉莉酸甲酯诱导上调表达，并且生物碱含量也相应增加，表明这两个基因可能参与生物碱的积累和转运；NtWBC13转运蛋白具有吸收体外烟碱的能力，在烟草根中起到积累或收集烟碱的作用。

本课题组前期对不同烟碱含量的烟草材料进行差异蛋白质组学分析时，筛选到可能影响烟碱含量的NtABCG6L蛋白（登录号：AOAIS3X176）。该蛋白为ABC转运蛋白G家族成员，推测NtABCG6L基因可能具有与烟碱转运相关的功能。本研究利用生物信息学方法对NtABCG6L的结构和生物学功能进行预测，并分析该基因在烟草打顶不同时间、不同器官中的差异表达，以及其表达量与烟碱转运效率的相关性，以期为进一步验证和明确该基因的烟碱转运功能提供依据。

1材料与方法

1.1材料种植与样品采集

供试烟草品种为K326，2022年2月26日播种，4月20日移栽，种植于贵州大学烟草科研基地（安顺市杨武乡）。选取土地平整、肥力均匀的地块作为试验地，将其划分为3个小区，每个小区种植4行，每行15株，株距0.55 m，行距1.20 m。田间管理参照当地优质烤烟生产技术执行。

分别在6月23日打顶当天（打顶前）及打顶后7、14、21d，每个小区选3株长势一致的烟株，采集根、茎、叶样品，部分鲜样迅速于液氮中冻存，带回实验室-80℃保存：剩余样品105℃杀青30min，然后75℃烘干。

1.2NtABCG6L生物信息学分析

利用在线软件对NtABCG6L蛋白进行理化性质分析、保守结构域预测、二级结构和三级结构预测、信号肽分析、互作蛋白预测、蛋白质磷酸化预测、亚细胞定位预测、跨膜结构和启动子作用元件分析。通过NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和茄科基因组数据库（http：//solgenomics.net）进行Blastp比对，挑选20种同源性较高的物种，下载其氨基酸序列，使用DNAMAN对烟草和这些物种的氨基酸序列进行多重比较，并用MEGA 11构建系统发育进化树。本研究所用软件名称及其相关信息见表1。

1.3NtABCG6L蛋白与烟碱的分子对接

分别在Uniprot蛋白数据库（www.uniprot.org）和ZINC数据库（zinc.docking.org）下载NtABCG6L（AOAIS3X176）的pdb格式文件和烟碱（ZINC391812）的m012格式文件，导入Autodock软件，加氢、去水分子后将两者进行对接验证，根据配体-蛋白对接模型的最低结合能判断成分与靶点的亲和能力，利用Discovery Studi0 4.5 Visualizer软件将对接结果进行可视化。

1.4NtABCG6L基因表达量及烟碱含量测定

分别将冻存的烟草根、茎、叶鲜样用灭菌预冷的研钵磨碎，利用RNA提取试剂盒（KK Fast Plant Total RNA Kit，庄盟生物公司）提取总RNA，用反转录试剂盒（FastKing cDNA，天根生化科技公司）将总RNA反转录为cDNA，然后利用荧光定量PCR仪进行qRT-PCR，所用引物见表2。PCR反应体系（20 uL）：2xtalent qPCR PreMix 10uL，10 umol/L qABCG6L-F引物0.6 uL，10umol/L qABCG6L-R引物0.6 uL，cDNA模板1uL，RNase-Free ddH20 7.8 uL。PCR扩增程序：95℃3 min；95℃5 s，57℃10 s，72℃15 s，40个循环。以L25基因作为内参计算Ct值，采用2-△△Ct法计算NtABCG6L基因的相对表达量。每个样品进行3次技术重复。

烟碱含量测定参考《烟草化学》的紫外分光光度法。烟碱转运系数为烟叶烟碱含量与根部烟碱含量的比值。

2结果与分析

2.1NtABCG6L生物信息学分析

2.1.1蛋白理化性质分析 如表3所示，NtAB-CG6L基因共编码729个氨基酸，分子式为CX84H5714N97001W8S29，原子总数11 445个，pl值为8.97，分子量为81.29 kDa，脂肪系数为89.20，不稳定系数为41.26，为不稳定蛋白。NtABCG6L蛋白中丝氨酸（Ser）的含量最高，有76个，占比10.4%；其次是亮氨酸（Leu），有71个，占9.7%；半胱氨酸（Cys）和酪氨酸（Tyr）含量较低，均低于10个。带负电荷的残基（Asp+Glu）数和带正电荷的残基（Arg+Lys）数分别为61个和69个。从亲／疏水性分析结果（图1）看，该蛋白序列中第589位氨基酸疏水性最高，分值为3.100，而亲水性最高的氨基酸分值为-2.878，处于第544位，平均亲水系数（GRAVY）为0.013，且疏水性氨基酸数大于亲水性氨基酸数，因此NtABCG6L属于疏水性蛋白。潜在的磷酸化位点预测结果（图2）表明，NtABCG6L蛋白具有多个磷酸化位点，包括60个丝氨酸（senne）位点、25个苏氨酸（threonine）位点以及7个酪氨酸（tyrosine）位点。预测到NtABCG6L蛋白主要被丝／苏氨酸蛋白激酶（CK1、CK2、CaM、GSK3）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）等磷酸化，从而参与烟草的各种生理生化过程。信号肽预测结果表明，NtABCG6L蛋白不含有信号肽，属于非分泌型蛋白。

2.1.2保守结构域和跨膜结构预测 结果（图3）显示，NtABCG6L蛋白存在ABC_transporter-Iike_ATP-bd、ABC_2_Uans等典型的ABC家族保守结构域，说明该蛋白属于ABC超家族：还存在1个ABCG_dom结构域，该结构域存在于多个ABCG家族成员中，且为NBD-TMD的反向序列，说明该蛋白属于ABCG亚家族成员。NtABCG6L蛋白的跨膜结构域由6个d螺旋结构组成。以上分析表明，NtABCG6L为NBD-TMD型的半分子ABCG跨膜转运蛋白。

2.1.3蛋白二级结构和三级结构 NtABCG6L蛋白的二级结构（图4A）主要由a-螺旋（alpha helix）和无规则卷曲（random coil）组成，分别占39.78qo和40.88%，延伸链（extended strand）和B转角（beta turn）分别占12.62%和6.72%．NtABCG6L蛋白的三级结构如图4B所示，其内部多个a-螺旋聚在一起形成较大的跨膜结构域，还有由B-折叠、a-螺旋、无规则卷曲等形成的NBD结合结构域。因此，推测该蛋白通过NBD与底物结合并释放能量，经跨膜结构通道进行运输。

2.1.4亚细胞定位及互作蛋白预测分析 亚细胞定位结果显示NtABCG6L定位于细胞膜，表明该蛋白是跨膜转运蛋白。对NtABCG6L的互作蛋白进行预测，结果（图5）共预测到10条与之可能存在互作网络关系的蛋白。其中AOAIS487Y3和AOAIS4D7E7是得分（均为0.905）最高的互作蛋白，通过Unipro数据库查询得知这两个蛋白均来源于烟草，且属于半分子ABCG家族的转运蛋白，因此推测NtABCG6L蛋白可能通过与AOAIS487Y3或AOAIS4D7E7形成异源二聚体发挥转运功能。

2.1.5顺式作用元件预测分析 以NtABCC6L基因起始密码子上游672 bp启动子序列，利用PlantCARE对其顺式作用元件进行分析，结果（表4）显示，其启动子区含有响应干旱、低温等非生物胁迫的作用元件（MYB和LTR），以及部分光响应元件（GATA-motif、I-box）。成熟期低温易造成烟碱含量增高，干旱也会使得烟碱含量发生显著变化。据此推测烟草植株在干旱或低温胁迫下NtABCG6L基因表达会发生变化，进而影响烟碱转运。

2.1.6系统进化分析 由于烟草属于茄科作物，因此在茄科数据库下载了番茄、辣椒、马铃薯、咖啡、茄子的蛋白序列文件，利用TBtools将其与NtAB-CC6L蛋白序列进行Blast比对，发现这些物种中均存在NtABCC6L的同源序列。用DNAMAN进行多序列比对，结果（图6）显示，茄子、马铃薯、番茄、辣椒的这些序列与NtABCG6L的序列相似性较高，分别为88.09%、88.09%、87.96%、86.60%，咖啡的序列与NtABCG6L序列相似度为74.83%。进一步对NtABCC6L蛋白和其他物种的同源序列构建系统进化树，结果（图7）显示，亲缘关系最近的是拟绒毛烟草和渐狭叶烟草，其次是茄子、马铃薯、番茄和辣椒。

2.2NtABCG6L蛋白与烟碱分子结合模式分析

为进一步验证NtABCG6L蛋白是可以转运烟碱的，下载NtABCG6L蛋白与烟碱分子的pdb文件，利用Autodock软件进行分子对接，分析二者结合模式。结果（图8）显示，ABCG6L与烟碱的活性结合位点由3个核心氨基酸组成，Lys28、Arg29、Lys729与烟碱吡啶环形成2个Ⅱ键、1个盐桥，Arg29与烟碱吡啶环上的氮原子形成氢键，Lys729与烟碱吡咯环上的氨基氢形成1个盐桥，总结合能为-2.95。表明NtABCG6L蛋白与烟碱可通过1个氢键、2个盐桥和2个Ⅱ键产生的结合力相互结合。推测NtABCG6L蛋白通过核苷酸结合结构域与烟碱结合，进而跨膜转运烟碱。

2.3NtABCG6L基因表达的组织特异性及其与烟碱转运的关系分析

结果（图9）显示，从打顶当天（0d）到打顶后21d，烟株根系烟碱含量较高且呈下降趋势，叶片烟碱含量呈上升趋势，茎烟碱含量较低且变化较小；烟碱转运系数在打顶后也逐渐增加。表明，烟碱是在烟株根系合成的，打顶后有明显的转运，即从根系向叶片转运积累，而茎提供运输渠道，并未存储烟碱。

NtABCG6L基因在打顶当天和打顶后7、14、21 d的烟株根中的表达量显著高于茎和叶中（P<0.01），而在茎、叶中的表达量差异不显著（图10），说明该基因具有组织表达特异性。对4个时期的烟碱转运系数和根系NtABCG6L基因表达量进行相关性分析，结果（图11）显示，两者间具有显著的线性正相关关系，R2值为0.943，P<0.05。说明在一定的条件范围内，NtABCG6L基因在烟株根系中的表达量增加能够增强烟碱的转运，据此推测NtABCG6L基因主要在烟草根部发挥转运烟碱的功能。

3讨论与结论

烟草是一种嗜好性经济作物，在国民经济中占有重要地位。烟碱是烟叶中最重要的化学成分，其含量是衡量烟草和卷烟质量的一项重要指标，是烟草商品价值的主要体现，其含量调控机制一直是烟草学科研究的重点之一。调控烟碱的转运是调控烟叶烟碱含量的途径之一。

ABCG家族是ABC转运蛋白中最为庞大的亚家族，已经在拟南芥、亚麻、水稻、玉米、葡萄和番茄等基因组中分别鉴定出43、85、50、54、71、70个ABCG基因，在烟草基因组中则鉴定到了134个ABCG基因。前人研究发现ABCG基因在代谢物转运方面起重要作用。如甘蓝型油菜（Brassica napus L）的BnABCG8可能参与脂质的运输，调控植物的生长发育；蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）的MtABCGIO负责4-香豆酸和甘草素的膜转运；螺旋藻（Spirulina）的SpTR2参与香紫苏醇的运输；青蒿（Artemisia caruifolia）的AaPDR3转运倍半萜烯B-石竹烯；长春花（Catharanthus roseus）的CrTPT2介导长春碱向叶片表面分泌。另有研究表明，烟草打顶后各部位烟碱含量均显著升高，其中叶片增加程度最大，说明打顶后烟碱的转运更强。本研究结果表明，打顶后烟草根中的烟碱含量显著下降，茎中的烟碱含量变化较小，叶中的烟碱含量显著增加。这与前人的研究结果不完全一致，可能是打顶时期以及生态条件不同所致。本研究还发现，烟碱转运系数与NtABCG6L基因在烟株根中的表达量呈显著线性正相关关系，表明NtABCG6L基因表达量越高，烟碱的转运越强，而且NtABCG6L蛋白与烟碱分子能够相互结合，因此推测NtABCG6L基因参与了烟碱的转运，但具体转运机制尚需深入研究。

综上，本研究结果表明，NtABCG6L基因共编码729个氨基酸：其编码蛋白具有ABCG亚家族典型的结构域ABC_transporter-Iike_ATP-bd．ABC_2_trans、ABCG_dom，属于ABCG家族，能通过氢键与烟碱结合，定位于细胞膜，存在跨膜结构，且具有多个磷酸化位点：打顶前后NtABCG6L主要在烟草根部高度表达，表达量与烟碱转运系数呈显著线性正相关关系，说明该基因可能主要在根部发挥转运烟碱的功能。后续将通过创制该基因过表达和敲除突变体来进一步验证NtABCG6L基因的功能。

作者贡献：龙本山是实验设计和实验研究的执行人：龙本山、莫泽君及罗家骏完成数据分析和论文初稿的写作：张静瑶、彭丽莎及段丽丽参与实验设计和实验结果分析；刘仁祥是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析和论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。