碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白质的条件优化

摘 要：以萌动苦荞蛋白质和碱性蛋白酶为试验材料，通过单因素和正交试验研究碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白质过程中温度、pH值、加酶量对水解效果的影响。结果表明，碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白质的最佳条件为控制水解温度45 ℃、pH值10、加酶量2 000 U·g-1、水解120 min，该条件下水解度为20.13%。

关键词：苦荞麦；萌动苦荞蛋白质；碱性蛋白酶；水解

Optimization of Alkaline Protease Hydrolysis of Germinating Tartary Buckwheat Protein

GAN Guochao1， CAI Li1， ZHONG Haixia1， CHEN Zhiguang2， XU Yuhang1

（1.College of Agricultural Sciences， Xichang University， Xichang 615013， China;

2.Panxi Crops Research and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province， Xichang University， Xichang 615013， China）

Abstract： The effects of temperature， pH and enzyme addition on the hydrolysis of germinating tartary buckwheat protein by alkaline protease were studied by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal conditions for alkaline protease to hydrolyze the germinating tartary buckwheat protein were

controlled by controlling the hydrolysis temperature of 45 ℃， pH 10， enzyme dosage of 2 000 U·g-1， and hydrolysis for 120 min，

and the degree of hydrolysis was 20.13%.

Keywords： tartary buckwheat; germinating tartary buckwheat protein; alkali protease; hydrolysis

在我国西南部，苦荞资源相当丰富，无论是品种数量还是产量，在世界上都稳居前列，具有极高的开发价值。苦荞含有丰富的营养物质，且具有保健功能[1]，越来越多的研究者以苦荞为原料制作食品产品、功能性保健品等。目前对苦荞食品的加工研究中，不仅仅局限于苦荞麦，而是包括整个苦荞植株，如茎、叶等部位，以及不同生长时期的苦荞麦。在苦荞各个部位中，有着各不相同的营养物质；在不同的苦荞食品中，添加的苦荞部位也各不相同，如苦荞茶中使用的是茎和叶；苦荞粉中使用的是苦荞籽[2]。苦荞籽粒经萌动后，体内大量高活性的胰蛋白酶抑制剂会逐渐被降解，为生长提供氮源。在萌动过程中会降低胰蛋白酶抑制剂对蛋白消化酶的抑制作用，从而提高蛋白质吸收率。苦荞麦萌动后总氨基酸含量比苦荞麦籽粒中蛋白质含量高，且检测到的多种氨基酸含量随萌发时间的延长明显提高[3-4]。

将萌动苦荞蛋白质水解后，蛋白分子结构疏松，相对分子质量减小，便于人体消化吸收，能使吸收率大大提高。本试验以凉山萌动苦荞粉为研究材料，通过单因素和正交试验研究碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白质的最优条件，以供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦荞籽粒：购于四川省凉山州航飞苦荞有限公司。

碱性蛋白酶，NaCl、NaOH、HCl、CuSO4、K2SO4、H2SO4、HBO3、NaOH均为AR级。

1.2 仪器与设备

TDL24型低速台式离心机，上海姚氏仪器设备厂；HH-6单列六孔恒温水浴锅，金坛市华城海纳仪器厂；PHS雷磁精密pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；FA2004电子天平，杭州汇尔仪器厂；KNC-08C全自动凯氏定氮仪，上海洪纪仪器厂；万能可调电炉，沈阳固而特商贸有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 萌动苦荞蛋白质的提取

萌动苦荞蛋白质的提取工艺流程见图1。

1.3.2 碱性蛋白酶水解条件的初步确定

试验以水解度为考察指标，研究碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白质的最佳条件。设置试验温度为35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃，试验pH值为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0，加酶量为2 000 U·g-1、3 000 U·g-1、4 000 U·g-1、5 000 U·g-1和6 000 U·g-1。除所研究的因素外，其他剩余各因素均取基本值（pH值10.0、温度45 ℃、加酶量3 000 U·g-1、底物浓度30 g·L-1、反应时间120 min）。

1.3.3 正交试验

以水解度为考察指标，根据单因素试验结果，通过3因素3水平正交试验确定碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白的最佳条件。正交试验因素水平表见表1。

1.3.4 蛋白质的测定

参考《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中凯氏定氮法测定样品中蛋白质含量[5]。

1.3.5 水解度的测定

参照杨文博等[6]提出的蛋白质水解度测定方法，采用甲醛滴定法进行蛋白质水解度测定。蛋白水解度=氨基酸总量（水解后）（mg）/样品蛋白质总量（mg）×100%。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度对水解效果的影响

由图2可知，随着温度的升高，蛋白质水解度呈先上升后下降的趋势。当温度在40～50 ℃时，对水解效果的影响较大；水解温度为45 ℃时，水解度最大。由此可以得出碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白的最适温度为45 ℃。

2.1.2 pH值对水解效果的影响

pH值对酶促反应的影响较大，如偏碱性或者偏酸性都有可能导致碱性蛋白酶的空间构象发生改变，从而使酶变性失活。在不同pH值条件下，底物的解离状态会发生不同程度的改变，从而影响底物与酶的结合能力。此外，pH值对酶促反应的影响，还体现在可能影响酶分子链上的部分氨基酸侧链的解离状态，特别是影响酶催化活性所需的某些氨基酸侧链基团的解离状态，从而影响酶的活性。对于碱性蛋白酶的适宜pH值范围为9.0～12.0。由图3可知，在本试验条件下，当pH值为10时，整个水解过程的水解度最高，由此可认为pH=10为碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白质的最适pH值。

2.1.3 加酶量对水解效果的影响

由图4可知，在不同的加酶量条件下，蛋白质水解度不同，且随着初始加酶量的提高而增大，但当加酶量达到一定数值后，其水解度的变化与最佳水解值相近并在一定范围内波动。分析可知，本试验条件下，加酶量的适宜范围为2 000～4 000 U·g-1。

2.2 正交试验结果分析

由表2可知，影响碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白试验的因素由小到大分别为加酶量、温度、pH值。分析K值得出的最佳的组合是A2B3C2，即温度45 ℃，pH值为10.0，加酶量为3 000 U·g-1。与正交表中最优组合（A2B3C1、A2B1C2和A3B2C1）不一致，因此进行验证性试验。综合考虑水解度、经济效益和实用价值，最终确定A2B3C1为最佳组合，即碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白的最佳条件为温度45 ℃、pH值为10.0、加酶量为2 000 U·g-1、水解120 min、底物浓度30 g·L-1。

3 结论

本文通过单因素和正交试验优化碱性蛋白酶水解萌动苦荞蛋白的水解条件，最终得出最佳的水解条件为温度45 ℃，pH值10.0，加酶量2 000 U·g-1、水解120 min、底物浓度30 g·L-1，该条件下水解度为20.13%。

参考文献

[1]余莎，甘国超，陈雪婷，等.凉山苦荞麦的营养价值及苦荞凉面的开发前景研究[J].现代食品，2023，29（3）：55-58.

[2]李楠，杨婷.不同干燥方式对萌芽苦荞功能成分及抗氧化活性的影响[J].运城学院学报，2023，41（3）：41-45.

[3]李兴美，何勇，唐再芬，等.苦荞麦不同部位化学成分的测定[J].饲料研究，2023，46（4）：113-117.

[4]吴颖，王啸，邱树毅，等.响应面法优化苦荞麦水溶性清蛋白提取工艺研究[J].食品研究与开发，2020，41（23）：105-111.

[5]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定：

GB 5009.5—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[6]杨文博，张英华.蛋白质水解度的测定方法研究[J].中国调味品，2014（3）：88-90.

基金项目：四川省重点实验室项目“苦荞米抗性淀粉的影响因素及机理研究”（SZ22ZZ01）；西昌学院科研项目“苦荞脂质分解相关酶的结构和酶活性特征研究”（YBZ202212）。