基于玉米醇溶蛋白（zein）-海藻酸钠构建木犀草素输送体系及果蔬保鲜研究

摘 要：本研究以玉米醇溶蛋白和海藻酸钠为原料，通过反溶剂法制备了负载木犀草素的复合颗粒溶液，并评价其对圣女果的保鲜效果。结果表明，当木犀草素与zein比例为1∶50时，颗粒的得率为78.19%，对木犀草素的包埋率为73.87%。体外抗氧化活性结果表明，与游离木犀草素相比，颗粒包埋可以提高木犀草素的抗氧化活性。对圣女果的保鲜效果结果表明，与游离木犀草素相比，包埋能够减少圣女果的水分含量损失，提高圣女果维生素C的含量，减缓圣女果硬度的损失，说明颗粒包埋有利于提高木犀草素的保鲜效果。本研究为果蔬保鲜提供了一条新途径，为生物活性的研究提供新的理论依据。

关键词：玉米醇溶蛋白-海藻酸钠纳米颗粒；木犀草素；抗氧化性活性；果蔬保鲜

Study on the Construction of Luteolin Transport System Based on Zein and Sodium Alginate and Preservation on

Fruit and Vegetable

LIANG Shiru， MENG Xinyi， HUANG Xinyi， HUANG Jinwei， ZHANG Hongyu， MA Juanjuan*

（Guangzhou Institute of Industry and Commerce， Foshan 528000， China）

Abstract： In this study， zein and sodium alginate were used as raw materials to prepare luteolin loaded composite particle solution by antisolvent method， and its fresh-keeping effect on cherry tomatoes was evaluated. The results showed that when the ratio of luteolin to zein was 1∶50， the particle yield was 78.19% and the embedding rate was 73.87%. The results of antioxidant activity in vitro showed that compared with free luteolin， particle embedding could improve the antioxidant activity of luteolin. The results showed that compared with free luteolin， embedding could reduce the loss of water content， increase the content of vitamin C in tomato and slow down the loss of tomato hardness， indicating that particle embedding was beneficial to improve the preservation effect of luteolin. This study provides a new way for fruit and vegetable preservation and a new theoretical basis for the study of biological activity.

Keywords： zein-sodium alginate nanoparticles; luteolin; antioxidant activity; fruit and vegetable fresh-keeping

现代食品行业越来越注重食品组分对人类健康的影响，大量的功能性活性物质被应用于食品及药用行业，木犀草素作为一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，具有丰富的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌及抗病毒等[1]。然而其水溶性差、稳定性低、代谢快、半衰期短以及生物利用度低等缺点，限制了木犀草素在食品行业中的应用[2]。因此，现代食品行业迫切需要制备一种食品级功能性成分荷载体系，来提高生物活性物质在食品加工、储存、消化吸收利用过程中的稳定性。而玉米醇溶蛋白（zein）是玉米加工过程中的副产物，来源丰富，具有独特的溶解性和自组装性质，利用反溶剂法使其自组装形成胶体颗粒，在制备输送载体领域具有广阔的应用前景[3]。利用生物大分子与蛋白之间的相互作用对颗粒性质进行调控，制备稳定性好、包埋率高的输送载体。相关研究表明，利用zein与壳聚糖复合形成稳定的纳米颗粒输送载体，可以明显提高槲皮素的溶解性和稳定性[4]。目前有关zein与海藻酸钠荷载木犀草素输送体系的研究较少，尤其在果蔬保鲜领域[5]。本文利用zein与海藻酸钠构建木犀草素输送体系，并以圣女果为果蔬代表，研究其在果蔬保鲜方面的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白（Sigma），海藻酸钠（合肥千盛生物科技有限公司），木犀草素（麦克林），无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司），氢氧化钠（西陇科学股份有限公司），DPPH（合肥巴斯夫生物科技有限公司），2，6-二氯靛酚（上海谱振生物科技有限公司），愈创木酚（国药集团化学试剂有限公司），新鲜的圣女果（市售），其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器，绍兴市越城区宸美仪器设备商行；N-1000S-SB2100旋转蒸发仪，上海泉杰仪器有限公司；FA2104电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DGJ-10C冷冻干燥器（普通型），上海博登生物科技有限公司；TDL-40台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒的制备

准确称取1 g玉米醇溶蛋白4份，按照木犀草素与玉米醇溶蛋白的质量比为1∶25、1∶50、1∶75、1∶100，称取一定量的木犀草素，然后分别加入

40 mL体积分数为80%的乙醇溶液，避光放入磁力搅拌器搅拌30 min，称取4份0.5 g海藻酸钠溶于100 mL蒸馏水，然后在搅拌条件下将zein-木犀草素溶液缓慢滴加到海藻酸钠溶液中，最后利用旋转蒸发除去乙醇直至样品体积为50 mL，再放入离心机3 500 r·min-1离心10 min，取上清液备用。按上述方法制备不含木犀草素的玉米醇溶蛋白-海藻酸钠样品作为空白对照组，将制备的胶体颗粒置于冰箱或冷冻干燥保存备用[6]。

1.3.2 木犀草素包埋率和颗粒得率的测定

将不同质量比的木犀草素与zein复合胶体颗粒冷冻干燥，称重后记录重量M，zein、海藻酸钠、木犀草素的总重量记为m，复合胶体颗粒得率=M/m×100%。木犀草素的包封率：首先利用乙醇将冻干颗粒表面的木犀草素溶解，收集上清液，然后在搅拌条件下将颗粒溶于70%乙醇溶液中萃取，离心后取上清液，利用紫外分光光度计在348 nm处测定吸光值[7]，根据绘制的标准曲线，计算颗粒中木犀草素的含量，木犀草素包埋率=颗粒中木犀草素的含量/木犀草素添加量×100%。

1.3.3 pH值对颗粒稳定性的影响

将制备的zein-木犀草素-海藻酸钠溶液利用NaOH（0.1 mol·L-1）或HCl（0.1 mol·L-1）调pH值至3、4、5、6、7、8，观察颗粒的稳定性。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的测定

利用蒸馏水稀释荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒，使其中木犀草素的浓度为50.000 μg·mL-1、25.000 μg·mL-1、12.500 μg·mL-1、6.260 μg·mL-1、3.125 µg·mL-1。以等浓度的游离木樨草素为对照，维生素C为阳性对照，空白颗粒为空白组。取2 mL样品溶液和2 mL DPPH自由基溶液混合，让混合物在室温避光条件下反应30 min[8]，随后用紫外可见分光光度计测定其在517 nm的吸光度，每组进行3个平行实验，DPPH自由基清除率的计算公式为

DPPH自由基清除率=（A0-A1）/A0×100%（1）

式中：A1为样品吸光值；A0为DPPH吸光值。

1.3.5 荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒对圣女果保鲜效果的研究

挑选外表皮无损坏、无软化现象的新鲜圣女果。将圣女果平均分组，分别用不同的溶液浸泡圣女果10 min，捞出擦干[9]，将试样放置于室温25 ℃条件下贮藏7 d，从第1天开始，每隔2 d测定一次，每次随机取3个果实，测试数据取平均值。用水浸泡的记为空白对照组；用游离木犀草素溶液浸泡的记为A组，设置浓度分别为12.5 µg·mL-1、25 µg·mL-1、50 µg·mL-1，记为A12.5、A25、A50；用玉米醇溶蛋白-海藻酸钠空白颗粒溶液浸泡的记为B组，设置浓度分别为12.5 µg·mL-1、25 µg·mL-1、50 µg·mL-1，记为B12.5、B25、B50；用木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠溶液浸泡的记为C组，设置浓度分别为12.5 µg·mL-1、25 µg·mL-1、50 µg·mL-1，记为C12.5、C25、C50，观察不同浓度的样品对于各项保鲜指标的影响。

（1）硬度的测定。对圣女果两侧上、中、下部位使用物性测试仪测定硬度，设定测前速度1 mm·s-1，测试速度2 mm·s-1，测试深度1 cm，取各组数据的平均值作为硬度测定结果。

（2）失重率的测定。失重率的测定采用称重法[10]，测定并记录各组圣女果原始质量W1（g），第1天、3天、5天、7天各测定1次质量，记为W2（g），失重率的计算公式为

η=（W1-W2）/W1×100%（2）

（3）维生素C含量的测定。采用2，6-二氯靛酚方法[11]对圣女果中维生素C含量进行测定。

（4）过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的测定。采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性。在试管中依次加入2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液、1.0 mL 2% H2O2、1.0 mL 0.05 mol·L-1愈创木酚，再加入0.1 mL 酶液，立即于34 ℃水浴中保温3 min，然后迅速稀释1倍，470 nm波长下比色，每隔1 min记录1次吸光度，共记录5次，以每分钟内吸光度变化0.01为1个酶活性单位（U·g-1）。以加热煮沸5 min的酶液作为对照。

1.4 数据分析

实验数据均为平行3次试验测定的平均值，采用Excel数据处理软件进行图表制作。利用SPSS软件进行方差分析，P＜0.05代表有显著性影响。

2 结果与分析

2.1 荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒的包埋率和得率

利用反溶剂法制备荷载木犀草素的玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒，在自组装过程中，木犀草素通过疏水相互作用和氢键包埋在颗粒内部。从图1可以看出，随木犀草素添加量的增加，颗粒得率没有显著变化（P＞0.05）。根据方法1.3.2绘制木犀草素标准曲线为y=0.014 6x+0.022 2，R2=0.999 3。从图1可以看出当木犀草素与zein的质量比为1∶50时，木犀草素的包埋率达到最大值；当木犀草素与zein的质量比为1∶25时，由于木犀草素的添加量过多，超出了颗粒的包埋能力，使更多的木犀草素黏附于颗粒表面，颗粒的聚集速度加快，使木犀草素析出，导致包埋率降低。综合考虑，选择木犀草素与zein质量比1∶50进行后续实验。

2.2 pH值对颗粒稳定性的影响

复合胶体颗粒主要是通过zein与海藻酸钠之间的相互作用形成。pH值对颗粒稳定性的影响如图2所示。当pH值在3～5时，没有沉淀生成；当pH值超过6时，开始出现沉淀，木犀草素逐渐析出。这是因为pH值较低时，zein颗粒表面带正电荷，zein-海藻酸钠之间的静电作用较强，阻止颗粒的聚集沉淀。当pH值增大到超过zein的等电点时，zein表面的电荷减少，导致zein-海藻酸钠之间的相互作用减弱，使颗粒出现沉淀。

2.3 DPPH自由基清除能力的测定

从图3可以看出，随着浓度增加，维生素C、zein-木犀草素、游离木犀草素及zein对DPPH自由基的清除率整体呈上升趋势，但当浓度为

50.000 μg·mL-1时，空白颗粒及荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒的自由基清除率降低。这可能是因为当蛋白浓度增大时，溶液混浊度增加，影响了溶液的显色，导致清除率降低。从图中可以看出空白颗粒对DPPH自由基的清除率显著低于游离木犀草素及荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒（P＜0.05），说明空白颗粒对DPPH自由基的清除率贡献度较小。与游离木犀草素相比，颗粒包埋可以提高木犀草素对自由基的清除能力，这是因为颗粒包埋有利于提高木犀草素的溶解性，增大木犀草素的有效作用浓度。综上所述，颗粒包埋有利于提高木犀草素的抗氧化活性。

2.4 荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒对圣女果保鲜效果的研究

2.4.1 荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒对圣女果感官的影响

对比贮藏前后果实外观、色泽的差异（图4）发现，贮藏期间所有圣女果的外观均发生了明显变化。贮藏前果实整体呈现鲜亮的红色，果实饱满，贮藏

7 d后，圣女果整体呈现暗红色，部分从饱满状态逐渐变为皱缩形态，均出现果实品质下降、外表腐烂的现象。其中，空白水处理的圣女果表面凹陷，表皮皱缩；A组圣女果出现腐败和病虫现象，A50组圣女果有较严重的变色现象，部分圣女果颜色变黄，表皮皱缩，当游离木犀草素浓度为25 μg·mL-1时，部分圣女果出现腐烂现象，其他浓度处理的圣女果多个果实表皮出现萎蔫的现象；B组出现了较严重的果实表面凹陷和表皮萎蔫现象，尤其B50组圣女果外观有发黄现象，部分圣女果开始腐烂，B25组圣女果表面呈现轻微萎缩；C组整体没有出现开裂、腐烂现象，个别果实存在表面缩皱和轻微凹陷现象，C50组个别圣女果出现菌斑，其中C25组圣女果外观明显好于其他组。该外观图与圣女果的硬度变化趋势基本一致（图5），25 µg·mL-1 zein-木犀草素处理的圣女果硬度最高。综上所述，颗粒浓度过高时，圣女果外观品质下降，可能是因为高浓度颗粒为微生物的生长繁殖提供能量来源，另外，木犀草素浓度越高，其对圣女果的保鲜效果越差，可能是因为木犀草素在高浓度下会激发圣女果内酶的活性，导致圣女果变质。与游离木犀草素相比，颗粒包埋有利于改善木犀草素的保鲜效果。因此选择木犀草素浓度为25 μg·mL-1对应的颗粒进行后续实验。综上所述，颗粒包埋在一定程度上可以改善果蔬外观，在一定的浓度范围内具有较好的保鲜效果。

2.4.2 荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒对圣女果失重率的影响

圣女果在采摘后仍有生命活动，在酶和激素的作用下仍会发生一系列的生理变化，导致水分流失，从而造成其重量的损失，导致果实品质下降和衰老腐烂，失去商品价值，因此失重率是衡量圣女果品质的重要指标之一[12]。从图6可以看出，随着贮藏时间的延长，圣女果的失重率均呈上升趋势，其中未处理圣女果的失重最严重，在贮藏第7天时失重率达到7.06%。与空白处理组相比，样品处理可以不同程度的降低圣女果的失水率。储藏7 d后，玉米醇溶蛋白-海藻酸钠空白颗粒（以下简称“空白颗粒”）溶液处理组与空白组圣女果的失水率没有显著性差异，但短期储藏可以减少圣女果的水分损失率，说明空白颗粒对圣女果的保鲜效果主要依靠空白颗粒在圣女果表面形成的保护膜，但长时间储藏效果较差。经颗粒包埋后圣女果的水分损失率为5.37%，略高于游离木犀草素处理组，这可能因为包埋影响了部分木犀草素的溶出，但总体趋势说明颗粒包埋在一定程度上可以提高木犀草素的保鲜效果。

2.4.3 荷载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒对圣女果过氧化物酶活性的影响

酶活性可作为判断伤害程度的指标，酶活性越高，说明果蔬损坏越严重。从图7可以看出，圣女果POD活性在贮藏过程中呈逐渐升高的趋势，这是因为果蔬采后活性氧的过度积累和膜质过氧化作用，促使POD加速清除活性氧的能力。贮藏7 d后，与空白组相比，经zein空白颗粒处理的圣女果中POD酶活性升高，说明空白颗粒对圣女果没有降低酶活性的作用，在短时间内对圣女果的保鲜是因为在其表面形成的保护膜，而不是因为颗粒的抗氧化活性；经游离木犀草素和颗粒处理的圣女果，其POD酶活性有不同程度的降低，与游离木犀草素相比，包埋对于降低酶活的效果较好，说明木犀草素可以通过抗氧化活性改善圣女果的保鲜效果。综上所述，经过包埋后的木犀草素更加有利于降低POD酶活性，说明对其保鲜效果更好。

2.4.4 荷载木犀草素zein-海藻酸钠对圣女果维生素C含量的影响

从图8可以看出，空白组（水）中维生素C在贮藏1～5 d呈现上升趋势，维生素C含量从10.727 mg/100 g上升至13.450 mg/100 g，这是因为水中贮藏能够促进果蔬维生素C合成，随后由于空气氧化，维生素C含量急剧下降。纯玉米醇溶蛋白颗粒处理组维生素C含量在贮藏期间没有发生显著性变化（P＞0.05）。纯游离木犀草素处理组维生素C含量在前5 d总体呈现下降趋势（从10.229 mg/100 g降低到8.602 mg/100 g），但第5天后可能由于果蔬代谢合成，维生素C含量上升到10.342 mg/100 g。经zein-木犀草素处理的圣女果中维生素C含量呈先降低后升高的趋势在，贮藏7 d后，其维生素C含量显著高于游离木犀草素和空白颗粒及水处理组（P＜0.05）。由此可见，zein-木犀草素颗粒对圣女果贮藏期间维生素C含量的保持效果最好，可能原因是zein-木犀草素处理会形成一层薄膜覆盖在圣女果表面，限制果实与外部环境的气体交换，有效减少氧气和水分的渗透，从而减缓果实中维生素C的氧化速度，降低果实中维生素C的流失速率。此外，木犀草素本身具有一定的抗氧化性，有助于减缓果实中维生素C的氧化过程。这种抗氧化性可能会增强zein-木犀草素薄膜对果实的保护效果，有助于维持维生素C含量。

3 结论

本文利用反溶剂法制备荷载木犀草素zein-海藻酸钠纳米颗粒，并研究包埋对木犀草素抗氧化活性及保鲜效果的研究。结果表明，在酸性条件下颗粒比较稳定，当木犀草素与zein的质量比为1∶50时，颗粒对木犀草素的包埋率可达73.87%，颗粒的得率为78.19%，包埋有利于提高木犀草素对DPPH自由基的清除能力。通过保鲜实验发现，负载木犀草素玉米醇溶蛋白-海藻酸钠颗粒主要通过改善圣女果的感官品质，降低失重率，降低硬度的损失，增加维生素C含量，降低过氧化物酶活性来达到保鲜效果。同时颗粒包埋在一定程度上可以提高木犀草素的保鲜效果，其作用机制可能是颗粒自身形成保护膜与木犀草素抗氧化活性的共同作用。

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基金项目：2022年广东省科技创新战略专项资金（pdjh2022b0613）。

作者简介：梁仕茹（1999—），女，广东湛江人，本科。研究方向：生物活性物质提取。

通信作者：马娟娟（1989—），女，山东潍坊人，博士，助教。研究方向：天然产物的开发利用。E-mail：1104971692@qq.com。