双调蛋白与支气管哮喘的相关研究进展

刘亚利 李媛 田广原 高笑宇 云春梅

双调蛋白最早于1988年被Shoyab等在人乳腺细胞MCF-7上清液中发现、分离并鉴定[1]。双调蛋白既是2型细胞因子,也是表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)家族的成员之一。因其既能够抑制某些癌细胞系的增殖,同时又能够诱导正常细胞(如成纤维细胞和角质细胞)的增殖,所以命名为“双调蛋白”[2]。在与表皮生长因子受体结合之后,双调蛋白激活控制细胞内代谢、增殖、细胞周期的信号转导通路,启动级联反应,参与器官发育、组织再生和伤口愈合相关的生物过程[3]。支气管哮喘是一种以肺部炎症、气道高反应性(airway hyperreactivity, AHR)、粘液分泌过多和气道重塑为特征的慢性气道疾病[4]。研究表明,AREG与慢性气道疾病相关,血液和唾液中的AREG可作为哮喘的生物标志物,且在哮喘急性发作期间,AREG的表达水平较哮喘稳定期明显升高[5]。因此研究哮喘与AREG的关系对于疾病的诊治至关重要。

一、双调蛋白概述

1. 双调蛋白的表达与释放

AREG在多种组织器官(气道、肺组织、结直肠、皮肤等)及细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞、Ⅱ型固有淋巴细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞)中均有表达[6]。AREG 在人体发育过程和体内平衡状态下具有组成性表达的特性,在组织损伤的修复及重塑、调控炎症、维持体内稳态中起着重要作用[7]。

AREG位于4号染色体q13-q21区域,包含DNA跨度约为10kb的拷贝基因AREG和AREGB[8]。AREG转录为由六个外显子组成的mRNA,编码252个氨基酸的跨膜双调蛋白前体(Pro-AREG)[2]。双调蛋白前体包含许多切割位点,一个疏水信号肽、一个具有糖基化位点的N末端亲水前区、一个含有另一糖基化部位和核定位信号的肝素结合(HB)结构域,以及EGF样结构域。这些位点的存在会导致不同类型的成熟双调蛋白,影响其在不同细胞类型中的生物活性。在肿瘤坏死因子转换酶( Tumor necrosis factor converting enzyme, TACE )的介导下,双调蛋白前体在结构外区域经过连续的蛋白水解,最终作为可溶性的AREG释放[9]。当可溶性AREG被释放到微环境中,AREG可能停留在细胞外基质中或到达血液从而发挥作用。明确AREG蛋白结构以及释放途径,对于了解AREG蛋白的生物学功能及作用至关重要。

2. 双调蛋白的生理功能及作用

AREG作为表皮生长因子家族成员之一,具有结合EGFR的能力。表皮生长因子受体是一种跨膜糖蛋白,是构成酪氨酸激酶受体ErbB家族的四个成员之一[10]。AREG可通过自分泌、旁分泌、细胞内核易位和被包含在外泌体中等方式进行分泌,随后与EGFR结合,启动信号传导[11]。同时AREG也可以与ErbB家族的其他受体ErbB2、ErbB3和ErbB4促进EGFR同聚或异聚,触发细胞内信号的产生,这些信号级联反应调节基因表达并引发多种细胞反应,如增殖、存活、侵袭、运动和血管生成等。虽然研究表明,与其他EGFR配体相比,AREG 在诱导EGFR对其他ErbB受体进行酪氨酸磷酸化反应的效率较低,但其生物活性与高浓度下的其他配体相似,这可能与对受体的亲和力以及AREG所行使的独特生理功能有关。

研究表明AREG不仅可以诱导有丝分裂信号,还可以诱导细胞分化,在协调组织稳态、组织修复、纤维化和抑制局部炎症方面发挥重要作用[6]。同时AREG还广泛的参与骨骼发育、神经再生、囊胚植入、角质形成、细胞增殖和纤维化等生理过程[12]。研究发现,正常骨骼发育也会受到AREG表达的影响,AREG的表达会由成骨细胞和骨组织的甲状旁腺激素和其他促骨激素触发。AREG还可参与乳腺发育,尤其是青春期乳腺导管的发育。同时,AREG已被证实在肿瘤的生物学中发挥重要作用。研究表明,AREG可以上调乳腺癌细胞中多种蛋白酶的表达,从而在乳腺癌侵袭和转移中发挥作用。AREG在肝癌组织和细胞中均有表达,并作为肝癌细胞的促有丝分裂和抗凋亡生长因子参与一系列的病理过程[13]。与人类胎儿成骨细胞系相比,人类骨肉瘤细胞系中AREG水平升高,外源性人类AREG治疗以剂量依赖性模式增加了两种人骨肉瘤细胞株的迁移,同时增加了伤口愈合活性和细胞运动性[14]。AREG在肿瘤学中的生物应用为肿瘤的靶向治疗提供了新的治疗方向。

此外,AREG在机体免疫以及炎症反应过程中扮演着重要的角色,当哺乳动物的皮肤、肺脏和肠道的屏障表面不断暴露于环境刺激,可能导致炎症和组织损伤。研究发现,在小鼠肠道损伤和炎症模型中,肠道的炎症标志物双调蛋白表达量增加,同时双调蛋白的受体,即表皮生长因子受体表达量也会增加[15]。T淋巴细胞是细胞免疫中的主要效应细胞,在免疫应答中产生细胞因子以介导炎症并调节其他类型的免疫细胞。感染鼠鞭虫的C57小鼠体内的Th2细胞亚群会分泌AREG,与T细胞受体结合发挥清除线虫的作用。类风湿性关节炎是一种慢性炎症性疾病,其主要特征是滑膜增生以及受影响关节的进行性破坏。AREG在类风湿性关节炎患者中的表达增加与促炎因子以及血管生成因子的产生有关[16]。总之,AREG在多种炎症疾病中发挥重要作用。

二、双调蛋白与哮喘

哮喘是一个严重的全球性健康问题,影响全球约3.5亿患者,在我国哮喘是常见病、多发病,已经成为主要的、亟需认真面对和解决的公共卫生与医疗保健问题之一[17]。作为一种多因素疾病,哮喘以遗传易感性和环境触发因素为特征,发作时伴有可逆性气道气流阻塞、非特异性气道高反应性和慢性气道炎症[18]。研究证明我国哮喘患者人数逐步上升,但因哮喘是复杂的基因与环境相互作用的结果,其临床表现、气道炎症、气道重塑的强度及类型具有高度异质性[19],导致哮喘的诊断率低,控制率低,治愈率低。所以深入了解哮喘的发病机制是一项重要的问题。

1. 哮喘的发病机制

哮喘是典型的环境和机体交互影响的疾病,其发病机制涉及适应性免疫和固有性免疫。适应性免疫应答分为两个阶段,在特定变应原刺激下机体会诱导Th2细胞合成和释放白细胞介素4(Interleukin-4, IL-4)、白细胞介素5(Interleukin-5,IL-5)和白细胞介素13(Interleukin-13, IL-13),促进IgE的产生进而导致气道炎症[20,21]。当过敏原再次进入机体,与IgE形成复合体迅速活化嗜碱性粒细胞和肥大细胞,使其释放多种炎症介质,包括细胞因子、趋化因子、组胺、5-羟色胺和蛋白酶,导致平滑肌收缩、血管通透性增强和炎性细胞的募集形成急性哮喘反应[22]。近年发现固有免疫应答也参与哮喘的发生、发展。Ⅱ型固有淋巴细胞(Innate lymphoid type-2 cells, ILC2)是起源于骨髓中的共同天然淋巴祖细胞,经由淋巴样祖细胞、早期淋巴样前体细胞、先天淋巴前体细胞等发育阶段分化而来的细胞群[23]。ILC2在肺稳态、损伤后肺结构的修复及重塑、过敏性炎症的引发以及免疫反应过程中发挥着关键作用[24-26]。研究发现,哮喘患者血液和痰液中ILC2含量增加,尤其在嗜酸性粒细胞型哮喘中[27]。在过敏原或微生物的刺激下,支气管上皮细胞(Bronchial epithelial cell, BEC)释放IL-33、IL-25和胸腺基质淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP),诱导支气管粘膜中的ILC2活化并释放IL-5、IL-13,促进嗜酸性粒细胞分化成熟并向肺部募集参与哮喘的炎症过程。同时ILC2还会通过分泌AREG来介导气道的修复从而发挥保护作用[28]。下面将重点综述AREG在哮喘中的研究进展。

2. 双调蛋白与哮喘中的炎症反应

白介素33(Interleukin-33, IL-33)是白介素1(IL-1)家族的一员,在屏障组织的内皮细胞和上皮细胞的细胞核中表达,它通过激活表达其ST2受体的各种靶细胞,如肥大细胞和ILC2,在2型先天免疫反应和过敏性炎症的启动和扩增中发挥核心作用[29]。在遗传学研究中,IL-33基因已被鉴定为哮喘的易感基因。遗传学研究表明,一个等位基因的突变会导致IL-33功能的丧失,从而减少血液中嗜酸性粒细胞的数量,并预防哮喘的发生[30]。研究表明IL-33可以通过诱导ILC2分泌AREG参与组织的修复和稳态[28]。ILC2既是AREG的先天来源,也是M2巨噬细胞分化的重要因素。M2巨噬细胞通过表达精氨酸酶和上皮有丝分裂原IGF-1来限制急性炎症、促进组织修复从而减轻蠕虫感染期间的急性肺损伤。IGF-1单独并不诱导上皮细胞增殖,但在EGF家族成员存在的情况下可以增强EGFR信号传导和增殖反应[31]。因此上皮细胞的有效有丝分裂刺激可能是由AREG和IGF-1的协调表达诱导的。而AREG诱导上皮细胞增殖和分化的能力可以在2型反应的情况下促进蠕虫的排出,并增强感染或损伤后的伤口愈合和组织修复从而抑制炎症损伤。

多种蛋白酶介导的蛋白酶水解也参与了哮喘发病过程,各种免疫细胞在过敏原刺激下释放内源性蛋白酶并参与炎症介质的产生、气道炎症细胞的浸润及气道高反应性[32]。人气道类胰蛋白酶(Human airway trypsin-like protease , HAT)是一种存在于慢性气道疾病患者痰液中的丝氨酸蛋白酶,是蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor 2, PAR-2)的激动剂[33]。研究表明,HAT通过PAR-2介导的ERK信号途径诱导AREG的产生,然后通过TACE依赖性机制促进双调蛋白的释放[34]。在气道上皮细胞系NCI-H292中,HAT通过AREG-EGFR 途径引起粘蛋白MUC5AC基因的表达,该基因表达的增加以及随后粘蛋白产生的增加可能导致粘液高分泌引起气道阻塞[35]。同时研究表明EGFR激活可降低claudin1基因的表达,增加MUC5AC的表达,同时造成更严重的气道炎症,以及气道高反应性增加[36]。综上所述,AREG广泛的参与哮喘过程中的气道粘液增加以及炎症发生。

3. 双调蛋白与哮喘中的气道重塑

气道重塑是指可能影响气道功能特性的气道结构变化。这些结构变化包括气道平滑肌质量增加、粘液腺肥大、细胞外基质成分沉积、网状基底膜增厚和血管生成。随着病情的进展,哮喘患者的肺功能会加速丧失,一些患者会发展为进行性固定气流阻塞。气道重塑通常发生于哮喘的早期阶段,伴随着炎症状态。Yukinori Enomoto等研究发现哮喘患者在急性发作后痰中EGF和AREG浓度暂时升高。哮喘支气管上皮中表皮生长因子受体(EGFR,也称为ErbB1)酪氨酸激酶的表达与疾病严重程度相关[37]。在哮喘患者的肥大细胞中也可观察到AREG表达上调,但在正常对照组中未观察到。当气道受到过敏原刺激时,肥大细胞通过脱颗粒的方法释放组胺,增加血管通透性、粘液分泌和气道平滑肌收缩而导致过敏反应。同时组胺通过刺激AREG的释放诱导气道平滑肌细胞和上皮细胞的增殖和迁移参与气道重塑[38]。因此干预肥大细胞释放组胺与AREG的过程可能成为治疗气道重塑的新方法。

研究表明AREG有助于过敏性疾病有关的细胞因子GM-CSF的释放,尘螨激活气道上皮细胞中的p38-MAPK信号传导途径诱导TACE和金属蛋白酶家族的另一成员裂解相邻细胞或其自身细胞表面上的AREG,从而驱动GM-CSF的产生[39]。GM-CSF通过活化巨噬细胞产生先天性免疫介质对气道直接作用而促成哮喘。GM-CSF还可以招募α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞,这可能有助于气道平滑肌增厚和气道高反应性,但GM-CSF是否直接刺激气道平滑肌细胞增殖或增生和AHR尚不清楚。肺纤维化是严重哮喘的常见病理学特征,其导致成纤维细胞增殖、细胞外间质沉积(例如纤连蛋白(FN)和胶原) ,以及肺泡上皮-间质转化[40]。AREG可诱导成纤维细胞增殖和纤维化基因(如胶原蛋白1-α1、α-SMA和FN)的表达。总而言之,AREG通过影响各种细胞因子的表达广泛的参与气道重塑过程,进一步研究AREG与气道重塑的关系有利于为哮喘的治疗提供新思路。

三、展望

双调蛋白在组织中发挥修复作用,调节修复机制对于避免组织损伤发挥重要作用。更深入的了解AREG基因表达与调控,以及与其他因子相互作用对于疾病的发生、发展、调控均具有重要作用。在目前的研究中AREG可以通过调节免疫反应参与多种疾病进程,例如研究发现AREG的表达上调会限制肠道的炎症以及促进组织的修复使其可能作为克罗恩病的纤维化治疗的新靶点[41]。同时AREG 还可以通过广泛下调致病性 T 细胞免疫而成为狼疮性肾炎的抗炎介质,进一步强调了 AREG/EGFR 轴作为潜在治疗靶点的重要意义[42]。虽然AREG已被证明既能在急性炎症反应中发挥抑炎作用,又能在慢性炎症中通过下调适应性T细胞免疫发挥强大的免疫对抗作用。但AREG 在哮喘中的相关研究较少,其具体抑炎或组织修复机制尚不明确。因此,在未来的研究中,我们将进一步集中AREG 在哮喘中的机制研究,探索AREG作为一种生物标志物在识别对靶向治疗有潜在反应的患者以及作为预后标志物的价值。