基于免疫微环境探讨养阴扶正解毒法治疗原发性肝癌*

蔡 雪 于莉华 刘晓利 闫慧文 解宇晴 杨志云△

1.北京中医药大学第一临床医学院 (北京, 100700) 2.首都医科大学附属北京地坛医院

2020年原发性肝癌发病率第6位,死亡率第3位,中国原发性肝癌新发病例数占全球的45.27%,死亡病例数占全球的47.12%[1],由此可见,原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一,我国是肝癌的高发地区。原发性肝癌复发率高,死亡率高,严重危害人类健康,大多数患者在发现时已经进入中晚期,错失根治性手术切除机会,介入治疗、放射治疗以及包括分子靶向治疗、免疫检查点抑制剂治疗在内的系统抗肿瘤治疗是中晚期肝癌的主要治疗方式,其中,不断更新的免疫治疗药物为肝癌患者带来更多希望,尽管目前免疫治疗取得重大进展,但是仍存在许多局限,更深入地了解肝癌免疫特征及机制具有重要意义。《原发性肝癌诊疗指南(2022年版)》中推荐在肝癌的不同时期运用中医方药配合西医治疗可控制症状、预防复发转移及延长患者生存[2],临床及基础实验研究证明中医药能够调控肝癌免疫,改善肝癌免疫抑制微环境[3,4]。本文从肝癌免疫的角度,探讨养阴扶正解毒法在肝癌免疫微环境中的治疗作用,为中医药抗肿瘤治疗提供理论依据。

1 肝癌免疫微环境

肝癌免疫微环境由免疫细胞、基质细胞等细胞成分以及细胞外基质(ECM)、细胞因子、趋化因子等非细胞成分共同组成[5]。免疫细胞中的CD8+T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)主要发挥免疫杀伤作用,肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Tregs)等主要发挥免疫抑制作用[6]。肝癌免疫微环境具有以下特征:①炎性:肝癌多在病毒性或酒精性肝炎基础上进展而来,是典型的炎性肿瘤;②酸性:肝癌细胞通过糖酵解途径代谢,肿瘤组织局部形成酸性微环境,肝癌在酸性条件下具有更强的侵袭性和转移性[7];③缺氧:肝癌细胞生长过快导致耗氧量增加,形成缺氧微环境[8];④肿瘤血管生成:缺氧微环境下缺氧诱导因子-1(HIF-1)刺激血管内皮生长因子(VEGF)等血管生成因子的表达,促进血管新生[8];⑤免疫抑制:肝癌细胞通过“免疫编辑”对机体免疫系统进行重塑,将肿瘤微环境“改造”成免疫抑制微环境,肝癌细胞中的上皮间质转化(EMT)通过间充质干细胞(MSC)和肿瘤相关成纤维细胞(CAF)诱导MDSC、TAM和Tregs分化,免疫抑制因子如白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β及CD8+T细胞表面的程序性死亡受体1(PD-1)和DC上的细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)表达增加[9],T细胞免疫杀伤功能减弱,肿瘤细胞因此发生免疫逃逸。由此可见,肿瘤细胞将免疫微环境“改造”为适宜其生长、增殖和转移的环境,如何改善肝癌免疫微环境、增强免疫细胞杀伤功能进而抑制肝癌进展是肝癌免疫治疗的关键。

2 基于免疫微环境认识肝癌中医病机

肝癌属中医“肝积”“癥瘕”“积聚”等范畴,肝癌发生的本质在于正气亏虚,癌毒内蕴。所谓“积之成者,正气不足,而后邪气踞之”,正气亏虚,脾失健运,湿热内停,土壅木郁,肝气失于条达,或气血乏源,肝血亏虚,久而久之在肝内形成瘀血、痰浊等病理产物,外来毒邪与内生病理产物互相结聚,形成肝癌。肿瘤局部微环境是肝癌发生发展的场所,有不少学者基于免疫微环境论述肝癌病机,有学者将肝癌局部免疫微环境划分为“正气”与“邪气”,具有肿瘤杀伤功能的免疫细胞属于“正气”;具有促进肿瘤细胞生长作用的属于“邪气”[10];何伟等[11]认为正气虚弱,免疫功能低下是形成免疫抑制微环境的核心病机;程海波等[12]认为炎性微环境是热毒的表现,高凝、肿瘤血管增生与血瘀相符合,而大量的黏附因子导致肿瘤转移与痰湿黏滞重浊、随气流窜的特点相符。因此,肿瘤微环境的动态变化体现了正邪斗争过程,机体正虚无力抗邪,则形成免疫抑制,表现为T细胞功能耗竭;瘀血、痰浊、癌毒等邪实凝聚,则形成炎性、酸性、缺氧的微环境特征。

2.1 脾失健运 《金匮要略》言“四季脾旺不受邪”,《素问·五癃津液别篇》言“脾为之卫”。脾是机体重要的免疫防御系统,脾虚与肝癌的发生密切相关,肝癌患者往往脾胃亏虚,正气不足,卫外失固,进而免疫防御功能和监视功能下降,肿瘤微环境中免疫细胞的识别和杀伤力降低,研究表明脾虚导致免疫功能低下,肝郁脾虚的肝癌小鼠T、B淋巴细胞增殖能力显著降低,细胞因子IL-2、γ-干扰素(IFN-γ)显著降低, IL-10、IL-4显著升高,小鼠免疫抑制显著[13]。脾为气血生化之源,脾胃运化和输布水谷精微,濡养五脏六腑,脾胃虚弱则运化无力,出现乏力、纳差、恶心呕吐、腹胀痛、形体消瘦等症状。肝癌患者脾虚存在物质的能量的代谢紊乱[14],脾虚与肿瘤细胞的能量代谢异常有关,脾虚造成肿瘤细胞的能量代谢重组,形成缺氧微环境[11]。于尔辛教授[15]提出“肝癌的本是脾虚”,采用健脾理气法能够调节小鼠T细胞和NK细胞, 抑制血管内皮细胞生长因子的表达和肿瘤血管形成,改善免疫功能。因此,脾失健运是肝癌发生的重要病机,脾虚导致机体免疫功能降低,有利于肝癌免疫抑制微环境形成,促进肝癌细胞生长、转移。

2.2 肝失疏泄 《格致余论》言“司疏泄者肝也”,肿瘤的发生与精神状态有十分密切的联系,肝癌患者常常情志抑郁,气机不得畅达,造成肝气郁结,血液瘀滞,形成实邪,正如《难经本义》言“积蓄也,言血脉不行,蓄积而成病也”,瘀血又进一步阻滞气血运行,导致肝脏失于濡养,造成肝血亏虚,表现为肌肤甲错、肝区疼痛、舌质紫黯、脉细涩或结代等,肝失疏泄与肝之阴血亏虚互为因果,抑制机体免疫功能,肿瘤局部微环境中免疫细胞功能失常,免疫杀伤功能减弱,肝癌进一步进展,研究表明肝肾阴虚小鼠CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD3+NK1.1+NK细胞比例均显著降低,肿瘤细胞呈浸润性生长,小鼠生存期显著缩短[16]。小柴胡汤和解少阳,方中柴胡升举阳气、疏肝解郁,其联合常规疗法治疗原发性肝癌TACE术后,可有效保护患者免疫功能,维持T细胞数量,提高患者生活质量[17];芍药软肝合剂中白芍养血柔肝,加之清热解毒、行气散结之药物,能提高荷瘤小鼠机体免疫功能,其能抑制荷瘤小鼠中VEGF的表达,从而抑制肿瘤生长[18]。因此,肝失疏泄、肝血亏虚是肝癌发生的重要病机,肝失疏泄导致免疫抑制,而养血柔肝、疏肝解郁之品能调节其免疫,增强机体免疫功能,延缓肝癌恶化。

2.3 癌毒内蕴 肝癌的致病因素包括饮酒、肝炎病毒、黄曲霉素等,这些在中医上均属于外来毒邪,正虚不能抵抗邪气,邪气久踞,形成肿块,肿块耗血伤津,加重肝脏阴血亏虚。另外,瘀血、痰浊等内生病理产物与外来毒邪互相凝结,阻滞气机,促进肿块生长,本虚与标实互根互用,形成恶性循环,使病情加重,这一过程与肿瘤细胞在免疫微环境中作用过程相似,机体免疫功能下降无法清除肿瘤细胞,肿瘤细胞在免疫微环境中诱导免疫抑制细胞分化,促进免疫抑制分子表达,进而抑制免疫细胞杀伤功能,肿瘤细胞发生免疫逃逸得以继续增殖,使得癌毒内蕴加强,正气进一步亏损,形成“因虚致实,因实致虚”的恶性循环。肝癌是典型的炎症相关肿瘤,肿瘤微环境中存在肿瘤相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞、IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性物质[19],加之缺营养、酸化的特点,对周围免疫细胞具有显著抑制[20],这与癌毒耗损正气、缠绵深痼的致病特点类似。另外,肿瘤外泌体是肿瘤微环境的重要组成部分,肿瘤外泌体可抑制免疫应答,增加肿瘤的侵袭转移能力,体现了癌毒走注流窜的特点[21]。因此,癌毒内蕴是肝癌发生的重要病机,解毒散结等祛邪法以改善肿瘤酸性、炎性、缺氧、免疫抑制微环境,从而恢复T细胞功能,抑制肝癌细胞增殖和转移。

3 养阴扶正解毒法调控肝癌免疫

扶正祛邪是中医治疗肝癌的根本法则,应贯穿肝癌治疗的始终。扶正应以益气养阴为主,振奋脏腑功能活动,旨在恢复脾之运化,肝之疏泄、藏血功能,提高机体免疫防御和免疫监视能力,改善CTL、NK等免疫细胞耗竭,恢复其杀伤作用;祛邪即削弱或清除病邪,以减轻其对机体的损害,应以化瘀解毒,软坚散结为主,佐以行气化痰,防止毒邪留恋,免疫学的角度即打击TAM、MDSC、Tregs等免疫抑制细胞,降低PD-1、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)等免疫抑制分子表达,阻断肿瘤细胞免疫抑制通路,多靶点、多途径介导肿瘤细胞凋亡,发挥中医药杀伤肿瘤细胞并抑制其增殖和转移的作用。

3.1 养阴扶正 “见肝之病,知肝传脾,当先实脾”,益气扶正是治疗肝癌的基本法则。肝脾功能联系密切,脾气健运,则肝气疏泄条达;气血生化充足,则肝血得藏。健脾养胃能够抑制肿瘤异常糖代谢, 清除其副产物,重塑肿瘤微环境[22],许多近现代医家认为益气扶正是抗癌的重要举措[23-25]。另外,肿瘤易耗血伤阴,肝阴是肝脏功能的基础,《临证指南医案》言“肝为刚脏,非柔润不能调和”,养阴柔肝对恢复肝之疏泄、藏血功能,重塑肝癌免疫微环境具有重要意义。《医宗必读·乙癸同源论》言“东方之木,无虚不可补,补肾即所以补肝”,因此,应运用滋水涵木法,同补肝肾之阴,使肝之疏泄条达。

养阴扶正法通过改善免疫功能对肝癌发挥治疗作用已经在许多研究中得到证实。如研究发现健脾益气方能够下调NLRP3炎症小体的表达、抑制细胞程序性坏死,改善肝癌免疫功能[26];益气养阴类中药可以显著提高CD4/CD8比值,增强巨噬细胞功能,改善免疫抑制状态,提高患者的免疫力[27]。本团队经验方养阴扶正解毒方(沙参、麦冬各15 g, 白花蛇舌草、生黄芪各20 g ,徐长卿12 g,柴胡、苦参、白术各9 g )用于肝癌的辅助治疗,本方具有养阴扶正、解毒散结之功效,能有效改善肝癌患者症状,延长患者生存,小鼠实验表明养阴扶正解毒方有效抑制肿瘤生长,增加脾脏和外周血及肿瘤组织的CD8+和CD3+T细胞的水平,降低CD8+T细胞表面共抑制分子PD-1、TIGIT和T细胞免疫球蛋白-3(TIM-3)的表达,恢复肿瘤浸润性T细胞的细胞毒性,延缓其凋亡。此外,治疗显著降低了外周血和肿瘤组织中炎症和免疫抑制细胞因子(包括IL-1β、IL-6和IL-10)的表达,增加了效应细胞因子TNF-α和IFN-γ的表达,改善T细胞耗竭和免疫抑制微环境[28,29]。因此,养阴扶正法可以改善炎性微环境,降低PD-1、TIM-3等免疫抑制分子表达,恢复T细胞毒性,减轻免疫抑制,进而加强免疫监控和免疫杀伤,从而抑制肝癌进展。

3.2 解毒散结 金元四大家之一张从正主张“先论攻邪,邪去而元气自复”、“邪气留则正气伤,邪气去则正气安”,祛邪应贯穿肝癌治疗始终。肝癌肿瘤局部“痰、郁、瘀、毒”结聚胶着,应治以活血化瘀,解毒散结为主,佐以行气化痰。活血化瘀以祛除瘀毒,改善肿瘤患者缺氧微环境,抑制肿瘤血管及癌栓形成;解毒散结以抑制炎性反应,降低炎症因子水平,介导肿瘤细胞凋亡;行气化痰以抑制肿瘤细胞糖酵解,减少乳酸堆积,改善酸性微环境,从而改善免疫抑制,抑制肿瘤生长。

研究表明解毒散结能够抑制肿瘤生长,改善肿瘤微环境免疫抑制。国医大师周仲瑛教授的经验方“消癌解毒方(白花蛇舌草、蜈蚣、僵蚕、麦冬等)”由清热解毒药、化痰祛瘀药和益气养阴药等组成,能够在肿瘤细胞凋亡和肿瘤血管生成方面发挥良好作用[12];复方斑蝥胶囊具有破血消瘀,攻毒蚀疮的功效,患者治疗后血清中VEGF、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)含量均明显降低,有效抑制肿瘤血管生成,改善缺氧免疫微环境[30];白花香莲解毒颗粒联合经肝动脉化疗栓塞术治疗HBV相关性肝癌,治疗4周后发现治疗组患者CD4+、CD4+/CD8上升水平以及CD8+下降水平均优于对照组[31];扶正解毒消积方增强初次TACE治疗的气阴两虚、毒瘀蕴积证肝癌患者的免疫功能,增强机体抗肿瘤能力,延长无进展生存期[32]。因此,解毒散结法能抑制肿瘤血管生成,降低缺氧诱导因子水平,维持T细胞水平,发挥抗肿瘤作用。

4 现代药理学研究

4.1 养阴扶正类中药 目前对中药单体调节肿瘤免疫的机制研究日益增多,黄芪多糖在体外以剂量和时间依赖的方式抑制CD4+CD25+Treg细胞的生长和增殖,其机制可能是通过降低肝癌局部微环境中FOXP3的表达并恢复细胞因子平衡,另外,黄芪多糖介导CXCR4/CXCL12通路来阻断SDF-1或其受体,从而抑制Treg细胞迁移[33],也有研究表明黄芪多糖能够通过miR-133a-3p/MSN轴减弱PD-L1介导的免疫抑制,产生抗肿瘤作用[4];人参皂苷Rg3抑制肝细胞癌Hep1-6、HepG2和SMMC 7721细胞活性并诱导细胞凋亡,另外,它可以增强淋巴细胞增殖以及IL-2和IFN-γ的分泌,从而抑制肿瘤生长[34];甘草多糖减少肝癌小鼠肿瘤微环境和脾脏淋巴结中的Treg细胞比例,降低Foxp3在Treg细胞中的表达,上调血清Th1/Th2细胞因子比率,抑制肿瘤生长[35];芍药苷通过抑制TGF-β1/Smads信号转导通路蛋白的表达强度抑制肝癌Hep G2细胞的侵袭和迁移[36]。因此,养阴扶正类中药能够调节不同分子及通路打击免疫抑制细胞Treg细胞的生长和增殖及迁移,增强T细胞增殖及杀伤力,或抑制PD-L1的表达,或通过阻断相关信号通路抑制肝癌细胞侵袭和迁移,从而达到治疗肝癌目的。

4.2 解毒散结类中药 解毒散结类中药经研究证实能够改善肝癌免疫微环境,介导肿瘤细胞凋亡。黄芩苷是黄芩的主要成分之一,其可以促进肿瘤相关巨噬细胞极化为M1样噬菌体,从而增强癌症细胞的自噬,另外,黄芩苷能够通过激活内质网激活转录因子6(ATF6)信号传导促进HepG2肝癌细胞凋亡[37],Ke等[38]研究证明黄芩苷降低STAT3活性,进一步下调IFN-γ诱导的PD-L1表达,从而恢复T细胞对肿瘤细胞的敏感性;大黄能够诱导肿瘤细胞凋亡抑制肝癌进展[39];穿心莲内酯能够抑制肝癌细胞中的VEGF,而VEGF是肝癌治疗的有效靶点[40];百花蛇舌草抑制肝癌细胞的增殖,诱导其凋亡,且可诱导Bax/Bcl-2比值上调,下调IL-6/STAT3信号通路活性[41,42]。因此,解毒散结类中药能够抑制肝癌细胞增殖,增强其自噬,诱导其凋亡,或下调PD-L1的表达,减轻T细胞耗竭,或抑制肿瘤血管生成,发挥抗肿瘤作用。

5 结语

目前,免疫疗法在肿瘤治疗中展现出良好前景,通过干预免疫微环境、改善免疫细胞耗竭功能是免疫治疗的主要机制,越来越多的研究证明,中医药能够多层次、多途径、多靶点改善免疫微环境,恢复肿瘤患者免疫功能,延长患者生存。本文从免疫微环境的角度探讨中医药对肝癌的免疫治疗作用,认为养阴扶正解毒法能较好地改善肝癌免疫功能,养阴扶正解毒法是本团队多年来治疗肝癌的基本治则,临床及实验研究证明能有效延长患者生存,改善肝癌免疫抑制微环境。中药复方作用机制复杂,未来还有许多未知需要我们探索。