响应面法优化桦树汁醋醋酸发酵工艺

曲薇　王玉红　姜秀煜　魏婷婷　贾鹏博

摘要：  以桦树汁为原料，筛选出适合桦树汁醋醋酸发酵的菌种；在此基础上，通过单因素和响应面试验优化桦树汁醋发酵工艺。结果表明：最适用于桦树汁醋酸发酵的商业菌种为沪酿1.01号醋酸菌；最佳发酵工艺为：初始酒精度7%、醋酸菌接种量11%、发酵温度28 ℃，此条件下酿造的桦树汁醋呈微黄色，透明澄清，入口清爽，具有果醋的酸味和桦树汁的清香，风格独特，以期为桦树汁醋工业化开发以及桦树汁的综合利用提供一定的理论基础。

关键词：  桦树汁；  桦树液醋；  菌种筛选；  发酵工艺；  响应面法

中图分类号：   TS 202. 1               文献标识码：   A                文章编号：１００1 － 9499（２０24）03 － 0041 － 06

Optimization of Acetic Acid Fermentation Process of Birch

Juice by Response Surface Methodology

QU Wei WANG Yuhong JIANG Xiuyu WEI Tingting JIA Pengbo**

（Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Forestry Sciences，  Heilongjiang Jiamusi 154000）

Abstract Using birch juice as raw material， the strains suitable for acetic acid fermentation of birch juice were screened. On this basis， the fermentation process of birch juice vinegar was optimized by single factor and response surface tests. The results showed that the most suitable commercial strain for acetic acid fermentation of birch juice was acetic acid bacterium HuNiang 1.01. The optimum fermentation process was as follows： the initial alcohol content was 7%， the inoculation amount of acetic acid bacteria was 11%， and the fermentation temperature was 28 ℃. Under these conditions， the brewing birch juice vinegar was slightly yellow， transparent and clear， and the mouth was fresh. It had the sour taste of fruit vinegar and the fragrance of birch juice， and the style was unique， in order to provide a certain theoretical basis for the industrial development of birch juice vinegar and the comprehensive utilization of birch juice.

Key words Birch juice; birch vinegar; strain screening; fermentation process; response surface methodology

樺树（Betula platyphylla）是桦木科落叶乔木，具有较强的适应性和抗寒性[ 1 ]，主要分布在我国的东北、西北以及西南山地区域[ 2 ]。将桦树树皮划开或在树身钻孔，会流出无色或淡黄色透明液体，带独特木质清香[ 3 ， 4 ]。桦树汁含有天然蛋白质和营养物质，但不同生长环境会对桦树汁中的营养成分、理化性质产生影响[ 5 ]。桦树汁中蕴含着人体所需的各种氨基酸[ 6 ]、矿物质、脂肪酸等常见营养成分，此外，还含有过氧化物酶、过氧化氢酶、桦芽酸、细胞分裂素、香精油和皂角甙化合物等活性成分[ 7 ]。

桦树汁具有祛痰止咳、促进人体新陈代谢、抗疲劳、增强机体免疫力等作用[ 8 ]。常见的桦树汁饮品主要以复合果汁饮料和果酒的形式[ 9 - 11 ]。目前，关于桦树汁醋的发酵产品鲜有报道[ 12 ]，而对桦树汁醋发酵工艺的系统研究更少。本研究以桦树液为主要原料，通过液态发酵工艺制备桦树汁醋。通过试验筛选适用于桦树汁醋醋酸发酵的商业菌种，并采用单因素和响应面试验优化桦树汁醋的发酵工艺，旨在为桦树汁醋工业化开发以及桦树汁的综合利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1. 1 材料与试剂

桦树液：采自伊春市带岭区东方红林场；白砂糖：天津市鼎盛鑫化工有限公司；壳聚糖（食品级）：广州天佳生物科技有限公司；澳大利亚DVI0酿酒酵母：上海杰兔工贸有限公司；许氏醋酸菌：上海保藏生物科技中心；巴氏醋酸菌：中科院微生物研究所；沪酿1.01号醋酸菌：上海工业微生物研究所；柠檬酸（分析纯）：长春健鹰食品添加剂公司；氢氧化钠（分析纯）哈尔滨新春化工产品有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1. 2 仪器与设备

ESJ182-4型电子天平：上海拓西电子科技有限公司；PHS-3C型精密pH計：杭州雷磁分析仪器厂；HJ-6磁力搅拌器：天津市滨海新区大港红杉实验设备厂；HWS-70B恒温恒湿箱：青岛明博环保科技有限公司；721紫外可见分光光度计：上海力辰仪器科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司。

1. 3 试验方法

1. 3. 1 桦树汁醋的加工工艺流程

桦树汁醋的加工工艺流程如图1所示。

（1）采集桦树汁

在桦树叶还未长出前，桦树汁开始流动时对桦树汁进行采集，并对采集的桦树汁进行密封后冷冻贮存。

（2）调节糖度、酸度

使用白砂糖将桦树汁的糖度调整为20%，使用柠檬酸将pH值调整为5.5。

（3）酒精发酵

在酿酒酵母中加入10倍质量的5%蔗糖溶液后，将其放置在32 ℃下活化20 min，得到酵母菌种子液。将酵母菌种子液接种到桦树汁中（接种量为0.3%），搅拌均匀后，置于温度为26 ℃，转速为130 r/min的条件下进行酒精发酵7 d。随后对桦树汁酒进行85 ℃灭菌处理15 min，冷却至室温后，待用。

（4）醋酸发酵

参照何宇宁[ 13 ]的方法将醋酸菌进行活化与培养，再将醋酸菌接种于桦树汁酒中，在温度为31 ℃，转速为130 r/min的条件下进行醋酸发酵，待醋酸含量不再增加时终止。

（5）澄清、过滤

参照王瑞璇的方法对桦树汁醋进行澄清处理[ 14 ]。

（6）杀菌、灌装

将澄清后的桦树汁醋置于80 ℃水浴下灭菌20 min后，无菌装瓶，即得桦树汁醋成品。

1. 3. 2 醋酸菌的筛选

将培养好的许氏醋酸菌、沪酿1.01号醋酸菌和巴氏醋酸菌分别作为1号、2号和3号醋酸菌种子液，并以11%的添加量加入到桦树汁中，在28 ℃下进行醋酸发酵，以桦树汁醋的总酸含量作为醋酸发酵状况的指标，选出发酵性能好，桦树汁醋口感佳的醋酸菌。

1. 3. 3 醋酸发酵的单因素实验

通过酒精发酵制得桦树汁酒，再对桦树汁酒进行醋酸发酵制得桦树汁醋。在实验过程中分别将初始酒精度、发酵温度和醋酸菌的接种量作为自变量，用酸度作为评价指标，探究不同的初始酒精度（5%、6%、7%、8%、9%）、发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）和醋酸菌接种量（5%、7%、9%、11%、13%）对桦树汁醋的影响。

1. 3. 4 醋酸发酵的工艺优化

在单因素试验的基础上，以初始酒精度（A）、发酵温度（B）和醋酸菌接种量（C）作为自变量，总酸作为响应值，进行响应面优化试验，相应水平设计见表1。

1. 3. 5 总酸含量测定

桦树汁发酵液酸度的测定参考国标GB/T5009.

239-2016《食品酸度的测定》酸碱滴定法。

1. 3. 6 感官评价

选择食品专业10名感官品评人员对桦树汁醋进行感官评价，并按照表2桦树汁醋的感官评分细则给予相应的分数。

1. 3. 7 微生物微指标测定

菌落总数、大肠菌群及沙门氏菌的测定分别参照GB 4789.2-2022、GB 4789.3-2016和GB 4789.4-2016项下方法及标准进行测定。

2 结果与分析

2. 1 醋酸菌的筛选

2. 1. 1 不同醋酸菌菌种对桦树汁发酵液产酸量的影响

从图2可以看出，随着发酵时间的增加，发酵液中酸度呈现先增高后平缓的现象。其中添加2号醋酸菌种子液的发酵液总酸含量最高达到5.30 g/  100 mL，并且发酵用时为8 d，最短；添加3号醋酸菌种子液的发酵液总酸含量最低为3.91 g/100mL，发酵用时为10 d。

2. 1. 2 不同醋酸菌菌种对桦树汁发酵醋感官品质的影响

由图3可知，选用2号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋整体可接受度最高，选用3号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋整体可接受度最低。色泽方面，选用2号醋酸菌种子液和1号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋评分相同，色泽差别较小，均呈现微黄色，光泽度较高，选用3号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋光泽度较差；香气方面，选用2号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋香气纯正，具有果醋的酸味和桦树汁的清香，评分最高，1号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋香气较淡，3号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋香气最次；口感方面，选用2号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋入口清爽、口味协调，1号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋入口较清爽、口味有待协调，3号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋入口无清爽感、口味差；澄清度方面，选用2号醋酸菌种子液和1号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋澄清透明，无肉眼可见的杂质，选用3号醋酸菌种子液发酵的桦树汁醋有少许沉淀物。

2. 2 桦树汁醋醋酸发酵单因素试验结果

2. 2. 1 发酵温度对桦树汁醋酸度的影响

将初始酒精含量为7%的桦树汁酒接种醋酸菌（接种量为11%）后分别在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃下进行醋酸发酵。从图4可以看出，发酵温度32 ℃发酵液中总酸最少，这主要归因于发酵温度过高时，醋酸菌的生长代谢过旺，以及高温对产物累积不利等因素所致[ 15 ]；发酵温度28 ℃时桦树汁醋发酵液中的总酸含量达到最大值；当温度低于28 ℃时，会使总酸含量较低，其原因可能是温度偏低导致醋酸菌的活跃性会有所下降。因此，桦树汁醋的最适发酵温度为28 ℃。

2. 2. 2 醋酸菌接种量对桦树汁醋酸度的影响

将初始酒精含量为7%的桦树汁酒分别接种5%、7%、9%、11%、13%的醋酸菌后，在28 ℃下進行醋酸发酵。从图5可以看出，发酵液内总酸含量随接种醋酸菌数量增多呈先升后降变化趋势，这是因为醋酸菌的产酸速度随着醋酸菌数量的增多而加快。醋酸菌接种量为11%时，发酵液内总酸含量达到最大值5.79 g/100 mL；醋酸菌接种量大于11%后发酵液总酸含量下降，这可能是因为醋酸菌接种量过大，菌体增长繁殖耗费了桦树汁发酵液内大部分营养，使得醋酸发酵相关的底物含量降低，不利于醋酸发酵；也可能是菌体快速消耗营养物质产生大量的代谢物质，使得醋酸菌提前衰老、自溶，从而降低了发酵液的总酸含量[ 16 ]。因此，桦树汁醋的最适醋酸菌接种量为11%。

2. 2. 3 初始酒精度对桦树汁醋酸度的影响

将初始酒精含量为5%、6%、7%、8%、9%的桦树汁酒分别接种醋酸菌（接种量为11%）后在28 ℃下进行醋酸发酵。从图6可以看出，随着初始酒精度数的升高，发酵液内总酸含量也逐渐升高。当初始酒精含量为7%时，桦树汁发酵液内总酸含量最高达到5.81 g/100 ml；当初始酒精含量高于7%时，发酵液内总酸含量出现下降的趋势，这可能是因为发酵初始阶段，高浓度的酒精使醋酸菌的成长、代谢受到限制，从而导致发酵液内总酸含量降低[ 17 ]。因此，桦树汁醋的最适初始酒精含量为7%。

2. 3 桦树汁醋醋酸发酵响应面试验结果

利用Design-Expert 13.0 软件对表3中的数据进行多元回归拟合，得到总酸与各因素的二次多项回归方程模型为：

总酸（g/100 mL）=5.80-0.055A+0.03B-0.1025C+0.005AB-0.055AC-0.105BC-0.6283A2-0.2733B2-0.3583C2。

由表4和图7可知，该模型F值为25.78，P值=0.001 1＜0.01，表明该模型因子具有显著性意义。模型的方程相关系数R2=0.978 9，校正系数R2Adj= 0.940 9，表明该模型的拟合度和可信度较好，可以对桦树汁醋醋酸发酵工艺进行预测和分析。各因素对总酸含量的影响依次为：发酵温度（B）<初始酒精度（A）<醋酸菌接种量（C）。通过软件Design-Expert 13.0分析，在初始酒精度为6.963%vol，发酵温度为28.167 ℃，醋酸菌接种量为10.694%时，醋酸发酵工艺最佳，此时桦树汁醋总酸含量理论值为5.807 g/100 mL。为了便于实际操作，对桦树汁醋最佳工艺参数进行修正，即初始酒精度为7%vol，发酵温度为28 ℃，醋酸菌接种量为11%。平行3次试验，桦树汁醋酸度实际值为（5.81±0.01）g/100 mL，与模型的理论预测值接近。因此，该模型可行。

2. 4 优化醋酸发酵工艺前、后桦树汁醋的感官评价

由图8可知，优化醋酸发酵工艺后桦树汁醋的香气、口感和整体可接受度大幅度提升。优化醋酸发酵工艺制得的桦树汁醋醋样为清亮透明的微黄色，无肉眼可见的杂质，香味协调，具有果醋的酸味和桦树汁的清香，入口清爽，整体可接受度高。

2. 5 桦树汁醋微生物指标检测结果

桦树汁醋的菌落总数为28 cfu/mL，未检出大肠菌群、致病菌，符合国标中微生物限量标准。

3 结 论

本试验筛选出适用于桦树汁醋醋酸发酵的商业菌种为沪酿1.01号醋酸菌。根据单因素试验和响应面试验得到的最佳发酵工艺条件为：发酵温度为28 ℃，醋酸菌接种量为11%，初始酒精度为7%。在此条件下制得的桦树汁醋酸度为5.81 g/100 mL，醋样呈现清亮透明的微黄色，无肉眼可见的杂质，香味协调，具有果醋的酸味和桦树汁的清香，入口清爽，整体可接受度高，且其微生物指标符合国家标准。

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