骨科MRSA感染危险因素分析及毒力耐药基因检测

蔡丽美 曹银新

【摘要】 目的 探讨骨科耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）感染危险因素，检测毒力、耐药基因。方法 从2021年1月—2023年2月梅州市第二中医医院与梅州市中医医院骨科住院患者中，选取100例感染MRSA与100例感染甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（methicillin sensitive staphylococcus aureu，MSSA）的病例。收集2组患者的一般资料以及临床资料，进行单因素方差分析。将差异有统计学意义的变量作为自变量，纳入多因素Logistic回归分析，得出MRSA的感染危险因素。对2组患者所有菌株进行毒力、耐药基因检测。结果 单因素分析结果发现，2组患者在年龄、基础疾病数量、侵入性操作数量、确诊前住院时间、抗感染药物应用数量和抗感染药物应用时间方面，差异有统计学意义（P＜0.05）。Logistic回归分析显示，年龄≥65岁、侵入性操作数量、抗感染药物应用数量≥2种、抗感染药物应用时间≥7 d是MRSA感染的独立危险因素。MRSA组患者的细胞毒素毒力基因[α-溶血素（hla）、杀白细胞素（pvl）]、超抗原毒力基因[肠毒素（asea）、表皮剥脱素（eta）、中毒性休克综合征毒素（tsst-1）]和耐药基因mecA的阳性检出率均高于MSSA组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 对于高龄、接收侵入性操作多、抗菌药物暴露多、应用久的骨科住院患者，应高度关注其MRSA的感染风险，早发现、早干预，为患者争取理想预后。

【关键词】 骨科；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；耐药性

文章编号：1672-1721（2024）10-0092-04     文献标志码：A     中国图书分类号：R446.5

金黄色葡萄球菌于1878年首次被Alexander Ogston发现，它是一种对人类健康构成严重威胁的致病菌，可引起人体各处感染，比如软组织感染、骨髓炎、肺炎、菌血症等，病死率约为80%[1]。青霉素在20世纪40年代被广泛用于临床后，产生了抗青霉素的菌株。到了20世纪60年代，大约80%的金黄色葡萄球菌对青霉素产生了耐药性[2]，给治疗带来了更多挑战。美国超过50%被分离出的金黄色葡萄球菌为MRSA[3]。MRSA是当前国内医院较常见的一种耐药细菌，Meta分析显示，MRSA的病死率明显高于MSSA（OR=1.93，P=0.001）[4]。与MSSA相比，MRSA的感染会增加患者住院时间及治疗费用。了解MRSA的危险因素并制定有效的防治方案，是目前临床上最主要的控制方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从2021年1月—2023年2月梅州市第二中医医院与梅州市中医医院骨科住院患者中，选取100例感染MRSA与100例感染MSSA的病例，分为MRSA组与MSSA组。MRSA组男性55例，女性45例；年龄19～79岁，平均（54.82±5.41）岁。MSSA组男性52例，女性48例，年龄18～78岁，平均（52.91±6.69）岁。本研究已经医院医学伦理委员会审批，患者及其家属知情并签署知情同意书。

纳入标准：入院48 h后发生感染或有植入物1年内的感染；感染部位标本进行微生物培养鉴定为首次分离出MRSA菌株或MSSA菌株。

排除标准：微生物培养呈阳性，但没有局部或全身症状感染者；由外院转入，收治时已发生感染者；临床资料不全者；妊娠或哺乳期妇女。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定

对所采集的菌株进行分离、鉴别，以常规方法与仪器检验相结合的方式进行鉴定。（1）常规方法。依据《全国临床检验操作规程》第3版[5]，菌株涂片革兰染色呈阳性，呈圆形、葡萄状排列，触酶、血浆凝固酶阳性，而发酵甘露醇和β-溶血环判定为金黄色葡萄球菌。（2）仪器检验。采用Vitek-2compact全自动细菌鉴别系统。MRSA鉴别，以肉汤微量稀释方法进行检测，用头孢西丁法测定金黄色葡萄球菌苯唑西林耐药性。在33～35 ℃条件下，以质量浓度为4 μg/mL的头孢西丁作为试验转折点，按标准的肉汤稀释方法培养细菌，16～20 h。最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）＞4 μg/mL判定为MRSA，MIC＜4 μg/mL为MSSA。

1.2.2 调查方法

依据制定的MRSA风险因子调查问卷，对MRSA、MSSA病人的基础及风险因子进行回顾性调查。本研究将在梅州市第二中医医院与梅州市中医医院专业医务人员的协助下进行。以非匹配病例对照试验为基础，探讨MRSA医院感染的危险因素。主要收集信息有：（1）一般信息，包括年齡、性别、科室情况、住院号、入院诊断、标本来源、采集时间等；（2）危险因素，包括基本疾病（心脑血管疾病，糖尿病，肿瘤、结构性肺病，肝肾功能不全）、侵入性治疗（种类和数量）、抗生素的使用（暴露时间和数量）等。

1.2.3 靶基因检测

在0.5 mL离心管内预置200 ng/mL蛋白酶K溶液200 μL，并置入培养菌落，56 ℃水浴2 h，再95 ℃水浴10 min，15 000 r/min离心30 s。取上清液作为基因检测模板液，并保存于-20 ℃冰箱中，使用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法进行基因检测，包括

2种细胞毒素毒力基因（hla，pvl）、2种超抗原毒力基因

（sea，eta、tsst-1）两大类5种毒力基因和耐药基因mecA。取每反应体系P1引物1 μL（1.0 μmol/L）、P2引物1 μL（1.0 μmol/L），d NTPs 2 μL（2 mmol/L），10倍缓冲液2 μL[KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO4 8 mmol/L，MgCl2 2 mmol/L，Tris-HCl（pH 9.0）10 mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%]，Taq DNApol 1 U（不计体积），组成靶基因的PCR扩增体系，加入模板液5 μL，超纯水9 μL。PCR扩增热循环按照以下步骤实施：93 ℃预变性2 min，93 ℃ 30 s—55 ℃ 30 s—72 ℃ 60 s，共循环35个周期，在72 ℃下延长至

5 min。试剂盒购自无锡克隆遗传技术研究所。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件分析数据，计数资料以百分比表示，行χ2检验，计量资料以x±s表示，行t检验，危险因素使用多因素Logistic回归分析，耐药性数据用构成比表示，α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 MRSA与MSSA感染的单因素分析

单因素分析结果发现，2组患者在年龄、基础疾病数量、侵入性操作数量、确诊前住院时间、抗感染药物应用数量和抗感染药物应用时间方面比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；2组其他方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 MRSA感染的非条件Logistic多因素分析

将单因素分析中差异有统计学意义的指标作为自变量，MRSA感染作为因变量，纳入Logistic回归分析。结果显示，年龄≥65岁、侵入性操作数量、抗感染药物应用数量≥2种、抗感染药物应用时间≥7 d是MRSA感染的独立危险因素，见表2。

2.3 毒力及耐药基因检测

MRSA组患者的细胞毒素毒力基因（hla、pvl）、超抗原毒力基因（sea、eta、tsst-1）和耐药基因mecA的阳性检出率均高于MSS组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

3 讨论

MRSA是一种常见的临床传染病，是全球公共卫生范围内一个重大的治疗难题。MRSA可分成两大类型，即社区获得性MRSA（community-acquired MRSA，

CA-MRSA）、医院获得性MRSA（hospital-acquired MRSA，HA-MRSA）。HA-MRSA的感染一般会因为病原体基因和耐药基因的表达而产生更强的耐药性[6]。MRSA的发病趋势、抗生素耐药性的差异，以及CA-MRSA、HA-MRSA等感染的出现都会对抗生素的应用和治疗效果产生一定的影响。尽管近年来不断有新的抗感染药物被引进，但MRSA依然是难治性耐药细菌ESKAPE（粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌，绿脓杆菌，肠杆菌）病原体的重要组成部分[7]。新的抗MRSA毒株活性和不易产生抗药性的药品开发日益受到重视。

本研究着重探讨了年龄、基础疾病、侵入性操作、确诊前住院时间、抗感染药物的应用种类和时间等危险因素。老年病人的免疫系统功能下降、抗感染能力下降，以及一些基础疾病引起的机体机能紊乱、细胞免疫功能下降等，是导致MRSA感染的高危因素。本项目涉及的5种侵入性操作，包括动静脉插管、气管插管、胃管留置、留置导尿和胸腔引流，均与MRSA感染相关。多因素分析显示，随着侵入性操作次数的增多，MRSA的检出增加，可能是由于侵入性手术操作会对人体正常的机械防护屏障造成损害。国内外已有相似的研究表明，侵袭性操作是MRSA感染的一个重要因素[8]。因此在进行有创治疗时，要谨慎权衡利弊，以免增加不必要的风险。本研究结果还表明，不同数量的抗感染药物及接触时间在MRSA和MASS患者中均有显著差异，为MRSA感染的独立危险因子。40.0%MRSA患者（40例）在治疗过程中应用了2种以上的抗感染药物，而仅有8%的MSSA患者应用了2种以上的抗感染药物。已有研究也有相似的结果[9]，长期服用多种类型的抗生素是MRSA感染的危险因子。再次提醒人们要正确应用抗感染药物，避免滥用抗生素。加强对抗生素的合理应用是防治MRSA的重要措施之一。

单因素分析结果显示，MRSA与MSSA患者的暴露因素中，基础疾病数量多在2组患者中的差异有统计学意义（P＜0.05），但Logistic回归分析未见显著性差异。已有研究表明，2种或2种以上的基础疾病更容易发生MRSA感染[10]。该研究结果与本研究的差异很有可能是因为对照组选取差异所致，本研究的对照组为MASS患者，而之前研究对照的患者为未感染MRSA人群。因此，基础疾病数量作为MRSA感染的独立风险因子，还有待于进一步研究证实。

本研究还发现，MRSA与MSSA组在确诊前住院时间≥7 d这一因素中的分布差异有统计学意义，而多因素分析结果显示，该差异并无统计学意义，可能是因为病原体分离前治疗时间和抗感染药物应用时间这2项因素并不存在相关性，确诊前住院时间越长并不意味着抗感染药物应用时间越长。

金黄色葡萄球菌细胞毒素可分为两大类，一种是溶血素，包括hla、hlb、hld；hlg和hlg-2等；另一种是杀白血细胞素，包括pvl，lukE，lukM，psm-mec等。與MSSA相比，MRSA组的hla、pvl阳性率明显高，其他研究人员也有相似的发现。hla是一种具有293个氨基酸的亲水蛋白，具有七聚体结构，神经节苷脂作为膜受体。而在哺乳动物的细胞膜中，几乎都含有神经节苷脂，从理论上讲，它会对人体的各个器官造成损害[11]。PVL膜受体是神经节苷脂/卵磷脂，几乎所有哺乳动物的细胞膜上都含有神经节苷脂/卵磷脂。研究人员在兔坏死性肺炎模型中发现，经肺内直接注入纯化PVL后，可使肺组织发生趋化、溶解，对肺部造成损害。

在超抗原毒性基因方面，超抗原是一种具有免疫干涉作用的毒素。其作用机制是通过活化各种免疫细胞，使机体分泌大量的白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、干扰素等，从而引起机体的免疫机能失调，主要表现为发热，白细胞增多或减少，毛细血管内皮受损，严重者还有弥散性血管内凝血、中毒性休克综合征、自身免疫疾病等表现。金黄色葡萄球菌的超抗原是一种有较强的非特异活化功能的特定抗原分子，能够较高程度地活化特定类型的免疫功能，在不需要抗体提呈的情况下，宿主在第一次感染时就能产生强烈的免疫反应，主要表现为食物中毒、中毒性休克综合征、金黄色葡萄球菌灼热综合征，还有一些病症会导致长期无法治愈，比如过敏性关节炎、特应性皮肤炎等。TSST-1也会引起胰岛素抵抗和葡萄糖代谢障碍，但是检测到的超抗原基因与死亡之间没有明显的关系。其他国家的研究也发现，在金黄色葡萄球菌MRSA中超抗原毒性基因sea、eta和tsst-1的表达水平明显增高[12]。

综上所述，对于高龄、接收侵入性操作多、抗感染药物暴露多、应用久的骨科住院患者，要高度关注其MRSA的感染风险，早发现，早干预，为患者争取理想预后。

参考文献

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（编辑：郭晓添）