不同地域来源广藿香中百秋李醇合成相关基因表达差异研究

王晓宇 梁晓欣 朱振远

摘 要 广藿香是我国岭南地区传统名贵中草药，其主要活性物质是百秋李醇，属于三环倍半萜化合物，在植物体内形成过程较复杂，目前已有研究主要集中在百秋李醇合成的相关基因。研究对 7种不同地域来源的广藿香种质中的4个百秋李醇合成调控相关基因（PatPTS、PatFPS、PatHMGR、PattTpsCF2）进行了表达差异分析，同时测定了不同来源广藿香样品中的百秋李醇含量。结果表明：在所检测的样品中，4个百秋李醇合成调控相关基因表达量与百秋李醇含量均存在地域差异；PatPTS、PatFPS、PatTpsCF2在不同来源广藿香样品中的表达差异与百秋李醇含量呈正相关；PatHMGR基因在广东高要和广东石牌2个广藿香样本中表现为高表达，而在其他广藿香样本中表达差异与百秋李醇含量呈正相关。此次研究结果可为不同来源广藿香药效成分快速鉴定和分子育种提供理论依据。

关键词 百秋李醇；合成基因；表达差异；广藿香

中图分类号：S567 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.06.001

广藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]为唇形科刺蕊草属植物，其干燥的地上部分为中药材广藿香，性辛、微温，属十大南药之一，具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑之功效，是藿香正气丸、抗病毒口服液等30多种中成药的重要原料，具有很高的经济价值[1]。百秋李醇也称为广藿香醇，是一种天然倍半萜类化合物，为广藿香油中含量最多的成分之一。《中国药典》中百秋李醇是评价广藿香及其精油品质的重要指标，也被认为是广藿香油药效功能和芳香功能的主要来源[2]。近年来，百秋李醇成为研究热点，针对其已经报道了多种有应用前景的药用活性，包括抗流感、抗抑郁、抗溃疡、抗炎、抗癌及对代谢性疾病的保护活性等[3]。

姚尹伊等对百秋李醇在广藿香体内合成途径已研究得较透彻，底物为2个乙酰CoA，合成乙酰乙酰CoA后，由HMG-CoA合酶催化形成3-羟基-3-甲基戊二单酰（HMG-CoA），经过一系列合酶催化形成甲羟戊酸、异戊烯基焦磷酸、牻牛儿基焦磷酸、法呢基焦磷酸等中间产物，最后形成百秋李醇[4]。整个合成过程存在4个限速酶，即HMG-CoA还原酶、法呢基焦磷酸合成酶、倍半萜合成酶和百秋李醇合成酶，其对应的基因分别为PatHMGR、PatFPS、PatPTS和PatTpsCF2[5-10]。此次研究采集了7个不同地域来源的广藿香，分别测定其百秋李醇含量，以及4个百秋李醇合成限速酶基因表达量差异，以期阐明百秋李醇合成相关基因与百秋李醇含量的关系，为进一步探索广藿香药效成分代谢途径，开发优质广藿香快速鉴定体系和遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为7份采集自不同地域的广藿香资源样品（见表1），利用扦插法种植于温室大棚。

1.2 试剂和仪器

Tris-HCl、EDTA、NaCl购自生工生物工程（上海）股份有限公司，SteadyPure通用型RNA提取试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、RNA free水购自湖北艾科瑞生物工程有限公司。引物均合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器有CFX96TM实时荧光定量PCR仪（Bio-RAD美国）、赫西 3H20R1台式高速冷冻离心机（湖北赫西仪器装备有限公司）、Nanodrop one超微量紫外分光光度计[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 广藿香百秋李醇含量测定

选取来自不同产地、生长期满1年、长势良好的广藿香植株地上部分（3个重复），阴干后用研磨机打成粉末，每份样品称取100 mg，按照《中国药典》（2020版）中的方法提取广藿香挥发油并测定百秋李醇含量。此次检验委托广州汇标检测技术中心完成。

1.3.2 总RNA提取与检测

选取长势一致的不同来源广藿香各3株（每株3个重复），采集叶片100 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 mL离心管，按照SteadyPure通用型RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，贮藏于-20 ℃或-80 ℃冰箱备用。按照Nanodrop one超微量紫外分光光度计操作说明测量RNA浓度。

1.3.3 反转录与qRT-PCR相对定量分析

按照SteadyPure通用型RNA提取试剂盒Evo M-MLV反转录试剂预混试剂盒说明书进行反转录，获得的cDNA贮藏于-20 ℃冰箱备用。

研究采用SYBR Green Pro Taq HS 预混型qPCR试剂盒进行qRT-PCR相对定量分析。利用18S rRNA基因作为内参基因，目标基因扩增引物序列如表2所示，qRT-PCR 反应体系为2×SYBR Green Pro Taq 10 ?L，cDNA模板1 ?L，引物F（10 ?M）0.5 ?L，引物R（10 ?M）0.5 ?L，ddH2O 8 ?L。

反应程序为95 ℃预變性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，60 ℃ 1 s读板，40个循环；65～95 ℃测定溶解曲线。

2 结果与分析

2.1 不同来源广藿香中百秋李醇合成相关基因的表达量分析

由图1（a）可知，百秋李醇合成酶基因（PatPTS）在海南万宁、广西横州、广东阳春、广东遂溪广藿香中表达量较高。由图1（b）可知，海南万宁广藿香中法呢基焦磷酸合成酶基因（PatFPS）的表达量明显高于其他地区。由图1（c）可知，倍半萜合成酶基因（PatTpsCF2）在海南万宁、广西横州广藿香中表达量较高，其他地域差异相对较小。由图1（d）可知，广东石牌、广东高要广藿香中HMG-CoA还原酶基因（PatHMGR）的表达量明显高于其他地区。

2.2 不同来源广藿香中百秋李醇含量差异分析

由图2可知，所有广藿香样本中中百秋李醇含量均超过最低指标（不低于0.1%），不同来源广藿香中百秋李醇含量有明显差异。其中，海南万宁、广西横州的广藿香中百秋李醇含量最高，分别为0.83%和0.64%；广东高要和广东石牌的广藿香中百秋李醇含量最低，分别为0.23%和0.14%；其余广藿香样本中百秋李醇含量差异较小，在0.30%～0.45%。

2.3 不同来源广藿香中百秋李醇合成相关基因表达量与百秋李醇含量关联性分析

由图3可知，关联性分析结果表明，PatPTS、PatFPS和PatTpsCF2在不同来源广藿香样品中的表达量与百秋李醇含量正相关。PatHMGR基因在广东高要和广东石牌2个广藿香样本中表现为高表达，而在其他广藿香樣本中表达量与百秋李醇含量呈正相关。

3 结论与讨论

《中国药典》（2020版）中规定了广藿香挥发油中百秋李醇含量不得低于0.1%。现代药理学也证明了百秋李醇具有重要的药用价值，如抗病毒、抗癌、消炎等。已有研究表明，广藿香萜类物质合成关键酶有十几种，但对于具体的调控机制还知之甚少。此次研究发现，4个已知的广藿香醇合成限速酶基因在不同地域来源广藿香中表达量存在差异。PatPTS、PatFPS和PatTpsCF2在不同来源广藿香样品中的表达量与百秋李醇含量呈正相关，进一步证明了法呢基焦磷酸合成酶、倍半萜合成酶和百秋李醇合成酶基因表达量直接影响百秋李醇含量，可作为广藿香质量快速鉴定的直接指标，为进一步研究广藿香药效质量快速检测方法和遗传改良提供了依据。

不同来源广藿香样品中PatHMGR基因在广东高要和广东石牌2个广藿香样本中表现为高表达。这是因为广藿香可分为醇型和酮型，广东高要和广东石碑的广藿香为牌香类，属于酮型广藿香，挥发油中广藿香酮含量较高。PatHMGR基因在广东高要和广东石牌2个广藿香样本高表达说明HMG-CoA还原酶是广藿香酮合成途径中的关键酶。此结果为进一步研究广藿香酮代谢途径提供了理论基础。

参考文献：

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