蒺藜与百部微乳凝胶面膜的制备及其抗氧化和美白作用研究

马宁珠 张建国 王振霖 齐娜

[摘要]目的：筛选最优处方制备含蒺藜与百部的微乳凝胶面膜，研究蒺藜与百部中药提取物的抗氧化活性及酪氨酸酶活性抑制作用。方法：通过构建伪三元相图和正交试验筛选微乳形成的最优处方；通过对中药面膜稳定性考察和感官评价判断面膜质量；采用2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH）自由基和超氧阴离子自由基清除实验考察中药提取物的体外抗氧化作用，并对中药提取物和中药面膜抑制酪氨酸酶活性作用进行研究。结果：微乳平均粒径为35.26 nm，PDI为0.029，理化性质稳定；中药面膜稳定性和感官评价良好。中药提取物对于DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力稍弱于维生素C，抗氧化性良好；中藥提取物和中药面膜对酪氨酸酶活性具有较好的抑制作用，稍弱于维生素C（P＜0.05），具有良好的美白作用。结论：本研究确定了含蒺藜、百部的复方中药微乳凝胶面膜的最佳制备处方，制备的面膜粘度适中，易于涂抹，稳定性良好，具有良好的抗氧化和美白作用。

[关键词]复方中药；微乳凝胶面膜；抗氧化；酪氨酸酶活性抑制

[中图分类号]TQ258.29    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）04-0059-06

Preparation and Whitening Effect of Tribulus Terrestris and Stemona Microemulsion Gel Mask

MA Ningzhu1， ZHANG Jianguo1， WANG Zhenlin1， QI Na1，2

（1.Department of Pharmacy， Guilin Medical University， Guilin 541004， Guangxi， China; 2.Department of Pharmacy， Integrated Hospital of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510315， Guangdong， China）

Abstract： Objective  The optimal formula of the microemulsion gel mask containing Tribulus terrestris and Stemona Stemona was screened， and the antioxidant activity and tyrosinase activity inhibition of extracts from Tribulus terrestris and Stemona Stemona were studied. Methods  The optimal formulation of microemulsion was screened by constructing pseudo ternary phase diagram and orthogonal test. The quality of Chinese herbal masks was judged by the stability investigation and sensory evaluation. DPPH free radical and superoxide anion free radical scavenging experiments were used to investigate the antioxidant activity of Chinese herbal extracts in vitro， and the inhibitory effects of Chinese herbal extracts and Chinese herbal masks on tyrosinase activity were studied. Results  The average particle size of microemulsion is 35.26 nm， PDI is 0.029， and its physicochemical properties are stable. The stability and perception of Chinese herbal masks are well evaluated. The scavenging ability of Chinese herbal extract for DPPH free radical and superoxide anion free radical is slightly weaker than that of vitamin C， and the antioxidant activity is good. Chinese herbal extracts and Chinese herbal masks have a good inhibitory effect on tyrosinase activity， which is slightly weaker than vitamin C （P＜0.05） and has a good whitening effect. Conclusion  In this study， the best preparation formula of compound Chinese medicine microemulsion gel mask containing Tribulus terrestris and Stemona Stemona was determined. The prepared mask has moderate viscosity， easy application， good stability， good antioxidation and whitening effect.

Key words： compound traditional Chinese medicine; microemulsion gel mask; antioxidant; tyrosinase activity inhibition

皮肤对人体抵御外界环境的干扰具有重要意义，但会受到紫外线照射和外来物质的伤害，其中紫外线照射对其影响最大[1]。皮肤经紫外线照射时间过长会使体内活性氧含量过多，黑色素增加，使皮肤暗沉，严重者会产生皮炎和皮肤癌[2-3]。因此，降低体内活性氧和黑色素含量是现在急需要解决的问题。

蒺藜是蒺藜科蒺藜属植物蒺藜（Tribulus terrestris L.）的果實，具有抗氧化和抗炎等多种药理活性，对糖尿病和心血管疾病等具有较好的治疗作用[4-5]。蒺藜提取物在一定浓度范围内可以对酪氨酸酶活性产生抑制效应，具有美白作用。百部为百部科植物直立百部（Stemona sessilifolia Miq.）、蔓生百部（Stemona japonica Miq.）或对叶百部（Stemona tuberosa lour）的干燥块根，具有抗炎、抗氧化和镇咳等药理活性，常用于治疗呼吸系统疾病[6]。百部根提取物对DPPH、ABTS抗氧化自由基均具有清除作用。微乳分散性好，能改善药物透皮吸收能力，在口服制剂、注射剂和透皮吸收制剂等方面都具有良好的应用[7]。其在经皮给药中具有渗透性好、药物吸收快和刺激性小的优点[8]。本研究制备蒺藜和百部微乳凝胶面膜，并探究蒺藜和百部提取物的抗氧化作用及其和中药面膜的美白作用，现报道如下。

1  材料和方法

1.1 实验试剂：棕榈酸异丙酯，抗坏血酸（西陇科学股份有限公司，广东）；左旋多巴，L-酪氨酸，吐温-80（北京索莱宝科技有限公司，北京）；无水乙醇（科隆化学品有限公司，四川）；邻苯三酚（Kayon公司，美国）；泊洛沙姆188（德国BASF公司，德国）；酪氨酸酶（Worthington公司，美国）。

1.2 实验仪器：涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；纳米粒度分析仪（英国Malvern有限公司）；气浴恒温振荡器（常州国华有限公司）；集热式恒温磁力加热搅拌器（上海力辰仪器科技有限公司）；电子分析天平（德国Sartirius公司）；酶标仪（瑞士Tecan公司）；紫外可见分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 复方中药提取：称取60.0 g复方中药样品（蒺藜和百部各30.0 g），300 ml 75%乙醇浸泡6 h，按乙醇∶中药粗粉滤渣=5∶1（ml/g）的比例，80℃冷凝回流提取60 min，超声提取60 min。滤液浓缩成约15 ml浸膏。

1.3.2 伪三元相图构建：以伪三元相图微乳区面积为指标评价微乳形成难易程度，微乳区面积大小与易于形成微乳的程度成正相关[9]。将乳化剂和助乳化剂混合得到混合相记为Smix，将Smix和油相按质量比为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例混匀，将水相缓慢滴加至混合油相中，记录体系由浑浊变为澄清时对应的水相加入量[10]。

1.3.3 处方筛选：将油相、乳化剂、助乳化剂作为试验因素，记作A、B、C，进行三因素三水平正交试验，选用L9（34）正交表。因素水平见表1，正交试验方案见表2。制备微乳并采用Origin 8.0软件绘制伪三元相图。

1.3.4 中药微乳质量评价：在微乳中滴加去离子水，观察其与水混溶情况确定类型并使用马尔文粒度仪测定其粒径以及多分散性指数PDI，采用透射电镜拍摄观察微乳形态。将微乳以4 000 r/min离心15 min，观察有无分层或沉淀出现来考察其离心稳定性。

1.3.5 中药面膜的制备：将卡波姆940研细后加入中药微乳中，待其充分溶胀后搅拌均匀，加入三乙醇胺调节pH值，制得中药微乳凝胶面膜。

1.3.6 中药面膜质量评价：将面膜于（40±1）℃和（-5±1）℃条件下保存24 h，实验前后面膜外观和pH值有明显变化记为（+），反之记为（-）[9]。将面膜以4 000 r/min离心15 min，离心后有分层或沉淀出现记为（+），反之记为（-）。3位面膜使用者根据表3对面膜进行评分，取平均值作为感官评价结果。

1.3.7 抗氧化性考察

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力：以5、10、25、40、50、100、150μg/ml中药提取物或维生素C为样品溶液。50μl样品加150μl DPPH溶液作为样品组，50μl样品加150μl无水乙醇为对照组，50μl去离子水加150μl DPPH溶液为空白组，37℃避光反应40 min后于516 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率计算公式：清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。式中Ai是样品组吸光度值；Aj是对照组吸光度值；Ac是空白组吸光度值。

1.3.7.2 超氧阴离子自由基清除能力：10、50、65、100、200μg/ml中药提取物或维生素C为样品溶液。加入150μl Trist-HCl、50μl样品和20μl邻苯三酚为样品组，0.01 mol/L HCl代替邻苯三酚为对照组，去离子水代替样品为空白组，325 nm处测定反应10 min每分钟的吸光度记为A1、A2和A3。以吸光值A对反应时间t作线性关系图，斜率为Vt，超氧阴离子自由基清除率计算公式：清除率（%）=[1-（Vt1-Vt2）/Vt3]×100%。式中Vt1是样品组线性关系斜率；Vt2是对照组线性关系斜率；Vt3是空白组线性关系斜率。

1.3.8 酪氨酸酶活性抑制：通过文献报导和预实验结果，将酪氨酸单酚酶和二酚酶检测时间定为反应后20 min和15 min。

1.3.8.1 二酚酶活性抑制率测定：10、100、300、500、800、1 200μg/ml中药提取物或中药面膜或维生素C为样品溶液。加入50μl样品、100μl PBS和100μl左旋多巴为样品组，不加样品为空白组，不加酪氨酸酶为对照组，不加样品和酪氨酸酶为空白对照组，37℃反应10 min后，加入50μl酪氨酸酶，恒温反应15 min于490 nm处测定吸光度。

1.3.8.2 单酚酶活性抑制率测定：10、50、100、300、500、800μg/ml中药提取物或中药面膜或维生素C为样品溶液。加入50μl样品、100μl PBS和100μl 0.5 mmol/L的L-酪氨酸作为样品组，不加样品作为空白组；不加酪氨酸酶作为对照组；不加样品和酪氨酸酶为空白对照组，37℃反应10 min后，加入50μl酪氨酸酶，恒温反应20 min于490 nm处测定吸光度。以样品浓度对酪氨酸酶抑制率作图并计算IC50值。酪氨酸酶活性抑制率计算公式：抑制率（%）=[（A2-A3）-（A1-A4）]/（A2-A3）×100%。式中A1为样品组吸光度，A2为空白组吸光度，A3为空白对照组吸光度，A4为对照组吸光度。

1.4 统计学分析：实验数据通过GraphPad Prism 5及Origin 8进行作图分析。采用SPSS 25进行统计学分析。

2  结果

2.1 微乳处方筛选：使用伪三元相图和正交试验对微乳处方进行筛选，图1A～I分别对应正交试验方案中1～9号试验处方得到的伪三元相图。微乳面积大小分别为G＞H＞A＞B＞I＞C＞D＞E＞F，说明7号处方最容易形成微乳，6号处方最不容易形成微乳。A因素即油相为影响微乳区面积占比的主要因素，B因素和C因素即乳化剂和助乳化剂为次要因素，最优组合为A3B1C2（见表4）。并且7号处方制备得到的微乳区面积占比最大，最容易形成微乳，因此选择7号处方制备微乳。有研究表明相比于单一表面活性剂，两种表面活性剂混合制备的微乳粒径更小，稳定性更好，载药量更高[11]。综合考虑，油相选择橄榄油和棕榈酸异丙酯，乳化剂选择安全性较高的吐温80和泊洛沙姆188；助乳化剂选择丙二醇和丙三醇。中药面膜处方的各成分及比例见表5。

2.2 微乳质量评价：样品加入蒸馏水后离心，未见分层，说明制备的微乳为O/W型。微乳平均粒径为35.26 nm，PDI为0.029，分散性良好。结果显示，微乳为类球形，分散均匀，不聚集。离心后的微乳未出现分层和明显沉淀现象，表明微乳具有良好稳定性。见图2。

2.3 中药面膜质量评价：结果显示，样品在耐寒、耐热和离心稳定性实验中，其外观和pH等均未出现明显变化，未出现分层和沉淀现象，说明制备得到的面膜稳定性良好。中药面膜在感官上表现为黏度适中[（3.3±0.10）分]、延展性适中[（3.5±0.12）分]、细腻度良好[（4.3±0.10）分]。

2.4 抗氧化性考察

2.4.1 DPPH自由基清除能力：結果显示，中药提取物对DPPH自由基具有清除能力并呈剂量依赖性，浓度越高，其对DPPH自由基的清除能力越强。总体上来看，其对于DPPH自由基的清除能力稍弱于维生素C（见图3）。维生素C对于DPPH自由基的IC50值为15.24μg/ml，中药提取物为20.89μg/ml，维生素C当量为0.73，这表明中药提取物具有较好的抗氧化性，但其抗氧化性不如维生素C。见表6。

2.4.2 超氧阴离子自由基清除能力：结果显示，与维生素C比较，中药提取物对于超氧阴离子自由基的清除率差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。维生素C对超氧阴离子自由基的IC50值为23.73μg/ml，中药提取物为36.94μg/ml，其维生素C当量为0.64，这表明中药提取物对于超氧阴离子自由基的清除能力略低于维生素C，抗氧化性良好。见表7。

2.5 酪氨酸酶活性考察

2.5.1 酪氨酸单酚酶活性抑制率：结果显示，与维生素C比较，中药面膜对单酚酶活性的抑制作用差异有统计学意义（P＜0.05），但仍具有较好的抑制作用和良好的美白效果（见图5）。与中药面膜比较，中药提取物对单酚酶活性的抑制作用差异有统计学意义（P＜0.01），并且中药面膜对单酚酶活性的抑制作用强于中药提取物。

注：*表示与维生素C组比较，P＜0.05，**表示与维生素C组比较，P＜0.01；#表示与提取物组比较，P＜0.01

图5  不同浓度维生素C、中药提取物和中药面膜对酪氨酸单酚酶活性抑制率比较

2.5.2 酪氨酸二酚酶活性抑制率：结果显示，与维生素C比较，中药面膜对二酚酶活性抑制作用差异有统计学意义（P＜0.05），与中药面膜比较，中药提取物对二酚酶活性抑制作用差异有统计学意义（P＜0.01），并且中药面膜对二酚酶活性抑制作用强于中药提取物，这表明将提取物制备成面膜后可以提高其对酪氨酸二酚酶活性抑制作用，与文献报道的将中药成分制备成微乳提高其对酪氨酸酶活性抑制作用是一致的[12]（见图6）。维生素C、中药提取物和中药面膜对于单酚酶的IC50值高于二酚酶，这表明上述药物对于酪氨酸二酚酶抑制作用更强。对于单酚酶和二酚酶，中药提取物对其IC50值均高于中药面膜IC50值，中药提取物的维生素C当量均低于中药面膜的维生素C当量，这表明将提取物制备成面膜后，其对酪氨酸酶活性的抑制作用增强。见表8。

3  讨论

面膜是一种美白护肤产品，对皮肤具有较好的保护作用，可以起到抗氧化、美白、淡斑和延缓衰老的作用，使皮肤更加细腻有光泽[13]。对于微乳凝胶面膜，一般需要加入乳化剂和助乳化剂来形成微乳，其中，毒性较小的非离子型表面活性剂如吐温-80是比较好的一种乳化剂[14]。助乳化剂一般选用丙二醇和丙三醇，刺激性和毒性较小，能增加微乳稳定性和保湿性[15]。本研究选用无刺激性和无毒性的卡波姆940作为凝胶剂，增加皮肤对面膜的吸收，并延长作用时间。制备得到的中药微乳凝胶面膜黏度和延展性好，稳定性良好。

白蒺藜的美白作用已得到明确证实，其水提物和醇提物对酪氨酸酶均具有较好的抑制作用，且其对于酪氨酸酶的作用具有双向调节性，表现为低浓度抑制和高浓度促进[16]。白蒺藜所含蒺藜皂苷具有抗氧化[17]和抑菌抗炎作用[18]，有研究表明其能够降低体内丙二醛含量，提高谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性，更好地清除自由基，起到抗氧化作用。百部具有抗氧化和抑菌能力，对酪氨酸酶抑制作用弱，其中百部多糖具有较好的抗氧化活性，对于超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基均具有清除作用，抗氧化性良好[6，19]。将蒺藜和百部提取物应用于化妆品中具有美白保湿和淡斑的作用。本研究比较了蒺藜、百部提取物和维生素C对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，以及中药提取物、中药面膜和维生素C对酪氨酸酶的抑制作用。研究发现中药提取物对上述自由基的清除能力略低于维生素C，抗氧化性良好。中药提取物和面膜对酪氨酸酶抑制作用均低于维生素C，具有较好的酪氨酸酶抑制作用和美白作用，因此本实验中复方中药对抗氧化作用以及对酪氨酸酶活性的抑制作用为蒺藜和百部提取物的共同作用。蒺藜和百部制备成面膜仍具有较好的抗氧化和美白作用。

综上所述，蒺藜、百部微乳凝胶面膜粘度和延展性好，稳定性良好，具有较好的抗氧化活性和美白作用，有开发和应用的价值，为后续开发蒺藜和百部化妆品提供理论依据。

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[收稿日期]2022-12-14

本文引用格式：马宁珠，张建国，王振霖，等.蒺藜与百部微乳凝胶面膜的制备及其抗氧化和美白作用研究[J].中国美容医学，2024，33（4）：59-64.