类器官模型在肝细胞癌中的研究进展

程兆瑞,骆圣华,伍德强,彭考明,舒源森,陈茄威,周 磊,王 彤

(中山大学附属第八医院急诊科,广东 深圳 518033)

原发性肝癌(PLC)是一组高度异质性肿瘤,其中最常见的类型为肝细胞癌(HCC)。作为全球癌症相关死亡的第三大原因,大多数HCC在慢性肝病的背景下发展,特别是乙型/丙型肝炎病毒(HBV/HCV)感染、酒精中毒、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和肝硬化[1]。早期至中期HCC的治疗方式包括手术切除、肝移植、局部消融和化疗栓塞等。然而,超过80%的HCC患者被诊断时已错过了最佳治疗时机[2]。迄今为止,晚期HCC的治疗是有限的。口服酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼或乐伐替尼作为美国食品药品监督管理局(FDA)批准的一线治疗用药,仅仅提供3个月的生存获益期[3-5]。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂仅仅使一小部分患者(约20%)显示出应答[6-7],同时,目前尚缺乏有效预测免疫疗法疗效的生物标志物[8]。因此,HCC治疗仍面临巨大困境,对肝癌发病机制进行深入探索以寻找潜在的治疗靶点、开发新兴治疗模式迫在眉睫。由于缺乏用于肿瘤研究的合适模型,开发新的HCC治疗策略受到阻碍。在过去的十年中,类器官作为强大的研究工具,在细胞分子层面协助探讨疾病机制,从而指导临床个体化医疗,在临床前和转化领域都引起了科学家们极大的兴趣[9]。本文首先将类器官与现有的传统肿瘤模型进行比较,继而探讨了类器官的起源、特性及其在肝癌中的应用进展。

1 现有HCC肿瘤模型的局限性

1.1 体外细胞模型

作为传统的肿瘤模型之一,2D细胞培养物以易于处理且快速生长的特性广泛应用于肿瘤研究。然而,该培养物缺乏调节细胞行为,包括分化、存活、增殖和迀移的关键基质细胞和免疫细胞,因此无法基于细胞-细胞/细胞-细胞外基质(ECM)间相互作用进行建模[10-11]。此外,在肝脏微环境中,不同位置的细胞接受不同水平的氧气和营养供应,缺氧和葡萄糖剥夺是HCC细胞恶性增殖的已知驱动因素[12-13]。而细胞培养物常常黏附于塑料培养基表面,形成单层细胞,直接均匀暴露于培养基内因子,因此从而无法复制肝脏内实际微环境。同时,细胞培养基尽管能够提供细胞存活和生长所必需的基本底物,但生长因子等要素缺乏将不可避免地导致肿瘤生物学相关途径的丧失,甚至可能偏离真正的肿瘤生物学过程[14-16]。

1.2 体内小鼠模型

目前已有多种方法用于建立肿瘤小鼠模型。化学致癌物二乙基亚硝胺(DEN)和四氯化碳(CCl4)可经经典炎症-纤维化-HCC轴诱导HCC小鼠,但其诱导的突变通常是未知的,使得后续模型构建进一步复杂化[17-18]。为了更好地研究人类特异性肿瘤微环境和免疫治疗,已经开发了人源化小鼠模型,即异种移植模型的变体。具体来说,人造血干细胞(HSC)可移植到免疫缺陷小鼠中,HSC重新填充骨髓并给予功能性人免疫系统,后续将患者来源的HCC细胞异种移植,从而提供体内平台以评估药物功效并研究肿瘤与免疫系统之间的特异性相互作用[19]。人源化小鼠中Foxp3+调节性T细胞的缺乏使得其重现复杂的抗肿瘤免疫过程与真实人体存在一定差异[20]。

2 HCC类器官的定义与起源

肝、胰和胆管类器官(HPB类器官)联盟由全球60多位专家组成,共同将类器官定义为源自原代细胞、干细胞/祖细胞或多能干细胞(PSC),通过复现组织内细胞-细胞和细胞-基质相互作用以维持组织结构和功能的三维结构[21]。此外,衍生自HCC组织的类器官被指定为术语“肝细胞癌类器官(HCCO)”[22-23]。

制作HCCO的基本步骤如下:1)用消化溶液(通常是胶原酶和DNA酶的共混物)解离成单细胞。2)将单细胞接种到基质胶(从鼠肉瘤分离的ECM)上。3)向培养基补充有模拟干细胞小生境信号传导所需的小分子及生物制剂混合物,如Y27632,即Rho相关蛋白激酶(ROCK)信号通路的抑制剂,用于防止细胞与周围ECM失锚定时的程序性细胞死亡;Wnt 3a和R-spondin,即Wnt信号传导通路激活剂,用于维持细胞干性,诱导恶性增殖[24-26]。BROUTIER等[22]是第一个成功地从人PLC开发类器官的团队。相比于匹配的健康肝脏组织,HCCOs形成紧凑的气泡样生长结构:围绕中心腔的导管样单层上皮细胞。即使在长期培养后,类器官也保留了与肿瘤组织相似的组织病理学和遗传特征。随后,NUCIFORO等[23]证明了可通过肿瘤针吸活检技术,对不适合或丧失手术机会的极早期或晚期HCC患者进行HCCO的构建,这极大程度地扩展了类器官在HCC中的应用前景,是一项变革性的发现[23]。另一种制作HCCO的方法是在健康肝脏类器官中诱导HCC形成。SUN等[27]通过过表达c-Myc从重编程的人肝细胞类器官中成功诱导了HCC。

3 HCCOs的特性

3.1 保留亲本组织特征

HCCOs高度保留了亲本的组织学结构、表达谱和基因组景观[28]。其中,各种HCC免疫组织化学标志物的表达水平均与亲本高度一致,包括甲胎蛋白(AFP)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、谷氨酰胺合成酶和热激蛋白70(HSP70)[23]。此外,肿瘤突变、扩增、拷贝数变异和突变标记在很大程度上反映了亲本HCC数据[23]。BROUTIER等[22-23]使用全外显子组测序,分别观察到,人HCCO在4个月或8次传代后保留了亲本组织中超过80%的免疫学突变。表观遗传变化在癌症中的作用也正被广泛研究。JOSHI等[29]观察到5种癌症类型(结肠直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌和肺癌)的类器官保留了相应原发肿瘤的DNA甲基化谱,可惜的是,HCC未被包含其中。总的来说,作为体外模型,类器官在其起源肿瘤的重演程度方面已显著优于传统细胞系,然而其仍缺乏某些参数如血管形成、神经支配和免疫细胞相互作用等。

3.2 保留肿瘤内异质性

肿瘤微环境(TME)内肿瘤发生与进化涉及到克隆扩展、遗传多样化和克隆选择的反复过程[30]。在单个肿瘤内,存在具有不同突变谱的不同细胞群,这种现象称为肿瘤内异质性。探索瘤内异质性在研究肿瘤耐药机制方面至关重要:早期,肿瘤治疗消除了易感的肿瘤克隆增殖,出现肿瘤缓解;然而,剩余的肿瘤亚群会通过基因突变等手段,改变其表型,从而逃避攻击,形成耐药。CALANDRINI等[31]研究分析了类器官内发生体细胞突变的癌细胞分数(CCF)(即具有给定基因突变的癌细胞比例),表明类器官培养物捕获了起源肿瘤内亚克隆特点,显著保留了瘤内异质性。此外,转录组分析显示,同一培养物中单个结直肠癌类器官中存在基因表达水平的细微差异,这种多克隆性对于科学家真正理解肿瘤演变、免疫逃避和耐药性等过程至关重要。

4 类器官的应用

4.1 研究HBV复制和HBV相关致癌作用

HBV感染是HCC发生发展的最主要风险因素之一,目前,HBV的研究模式可分为3种:细胞模型、动物模型和类器官模型。一般来说,细胞模型不适用于HBV相关致癌研究,尽管它们容易维持HBV复制状态且成本低廉。动物模型,特别是灵长类动物,支持形成HBV感染和免疫应答状态,但价格昂贵且难以维持。与上述2种模型相比,类器官模型具有易于进行遗传修饰、维持周期长、成本适中的优势[32]。

到目前为止,研究人员已经建立了2个肝脏类器官模型,用于描述HBV体外感染和复制的潜力,分别为NIE等[33]构建的多能干细胞衍生模型及DE CRIGNIS等[34]构建的成体干细胞衍生模型。NIE等[33]提取人诱导多能干细胞并建立了功能性肝类器官模型。在3D培养系统中,将hiPSC衍生的内胚层、间充质和内皮细胞与某种培养基共培养。基于细胞-细胞相互作用,当上述细胞分化时,出现自组织并产生功能性类器官。该功能性hiPSC-HCCO可支持完整的HBV生命周期并模拟HBV相关的肝功能障碍,真正重现宿主-病毒的相互作用。同样的,DE CRIGNIS等[34]也证明了由健康供体产生的肝类器官模型可以支持HBV在体外复制。当使用重组病毒和HBV感染的患者血清感染类器官时,研究人员在类器官培养的上清液中可以检测到HBV表面抗原(HBsAg)、HBV e抗原(HBeAg)、HBV核心蛋白,甚至共价闭合环状DNA(cccDNA),表明该类器官模型可以在扩增培养基中高效地生产HBV。有趣的是DE CRIGNIS等[34]从肝移植患者的非肿瘤肝硬化组织中生成了HBV感染患者来源的肝类器官。对患者来源的肝类器官的转录组学分析表明,存在一个异常的早期癌症基因标记。该标记与癌症基因组图谱(TCGA)内的HCC队列聚集在一起,同时远离健康的肝组织,提示着该基因标记可能是HBV介导肿瘤发生发展相关的新型生物标志物。由于类器官可以进行基因修饰,因此可以通过在肝细胞中外源表达HBx蛋白或其他候选病毒/宿主蛋白来研究原代肝细胞系统中的下游靶基因和致癌机制。

4.2 研究其他因素相关致癌作用

目前,对HCC相关致癌因素仍了解甚少,对肝脏类器官的广泛探索,有助于加深对HCC发生发展的认识。NARUSE等[35]基于小鼠组织来源的类器官,通过体外二乙基亚硝胺(DEN)诱导,建立了肝癌类器官模型。该模型显示出致癌的组织病理学特征,可用于研究早期分子事件,以阐明化学因素驱动的致癌作用。此外,SUN等[27]通过使人肝细胞重编程及p53和RB基因失活,建立了具有肝脏结构和功能的类器官。结果显示,c-Myc诱导的线粒体-内质网过度偶联可能是肝癌发展中未被识别的致癌事件,肝细胞癌发生发展可能与c-Myc过度表达密切相关,提示着c-Myc抑制剂有待被探索用于HCC治疗领域。总之,以hiHep类器官为代表的类器官作为通过基因操控来模拟癌症发生发展的有力工具,有助于科学家们更好地了解癌症的起源,从而提供潜在的预防治疗方案并提高肿瘤患者的生存率。

4.3 药物筛选和个体化医疗

PLC作为一种高度异质性疾病,其个体化治疗对于提高生存率、实现精准医疗至关重要。如上所述,来源于人PLC的肿瘤类器官充分保留了其来源组织的异质性,这表明类器官有望成为探索肿瘤耐药性和个体化医疗的有力工具。此外,肝癌类器官模型用于药物敏感性检测的最突出的优点之一在于其良好的重现性和逼真性。既往研究[22]也表明,肝脏类器官可以成功地模拟体内肝脏的功能,并长期增殖。与其他模型相比,类器官模型可以再现疾病特征,如突变特征、病理变化和治疗反应,并且可以更真实地预测出药物治疗反应[23]。

HCC类器官作为良好的体外模型已逐渐取代2D模型,用于对分子靶向药物(如索拉非尼)的敏感性测试。SONG等[36]使用类器官模型来测试索拉非尼的敏感性,发现3D结构并不会阻碍药物扩散而导致其预测疗效的灵敏度降低。与2D模型相比,类器官3D结构能够更精确地进行治疗反应的预测。这一有趣的发现从侧面证实了3D结构特征不是影响药物在组织结构中的运输和扩散的唯一因素。LI等[28]用5个手术标本中的不同切片构建了27种PLC(HCC和CAA)类器官,用来评估129种抗癌药物对其的活性。大多数药物仅在特定的类器官系中有效,这不仅证明了PLC内高度的遗传异质性,而且证明了瘤内药物反应的异质性。为解决PLC耐药性问题,LAMPIS等[37]利用PLC来源的类器官,分别评估了其在体外培养基和小鼠体内作为皮下异种移植物时对HSP 90抑制剂的反应。结果显示,无论是体内或是体外培养,患者源性类器官对HSP90抑制剂的敏感性取决于miRNA21的表达,证明miRNA21似乎介导PLC细胞对HSP90抑制剂的耐药性。类似地,一些研究基于PLC类器官模型,也发现了肿瘤耐药相关靶点。如Hedgehog信号传导和受体酪氨酸激酶诱导的MEK/ERK和AKT信号传导途径的再激活可能与索拉非尼耐药性相关[38-39]

5 小结与展望

本文综述了肝脏类器官的定义、起源及特性,并重点介绍了类器官在HBV及其他致癌因素相关肝癌研究及在药物筛选、寻找耐药相关靶点以实现个体化医疗中的应用价值。未来有望充分探索PLC类器官与肿瘤微环境细胞,如免疫细胞和血管细胞,从而利用PLC类器官对HBV感染下抗肿瘤免疫微环境进行更多的研究。此外,SKARDAL等[40]用结肠癌细胞接种肝类器官以产生肝转移瘤类器官,这种3D肝肿瘤类器官被证明是比2D细胞培养物更好的转移性肿瘤模型。即使不能完全模拟肝转移瘤的实际情况,但仍值得进一步研究。