大鼠VDAC1腺病毒过表达载体构建及功能鉴定

赵嘉仪,袁明明,王利军,赖松青,邹华西,黄 琼,刘季春,黄 璜

(南昌大学a.第一附属医院心脏大血管外科; b.焕奎书院,南昌 330006)

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株及质粒

293A细胞(腺病毒的包装细胞)和大鼠H9c2心肌样细胞株购自中国科学院细胞库,DH5α感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。腺病毒载体重组穿梭质粒和包装质粒由苏州吉玛基因股份有限公司构建制备提供。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶EcoRI(NEB,#R0101M)、XhoI(NEB,#R0146M),T4连接酶(NEB,M0202L)购自苏州吉玛基因股份有限公司。RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所。Anti-VDAC1/Porin抗体(ab14734),β-Actin鼠单克隆抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司。胎牛血清(FBS,C2027050)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。高效转染试剂盒HETkit购自深圳百恩维生物科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒和腺病毒Maxi纯化试剂盒购自上海百塞生物技术股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 ADV6-VDAC1病毒质粒构建

按照基因库(GeneBank)中的大鼠VDAC1基因编码序列(NM_031353.1)委托吉玛基因公司化学合成目的基因。采用ADV6(C1MV)为克隆载体,首先用EcoRI和BamHI对VDAC1(大鼠)基因片段和载体进行酶切,37 ℃孵育2 h。进行凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收目的VDAC1基因片段和载体ADV6。用T4 DNA连接酶连接双酶切后得到的线性化的载体和大鼠VDAC1基因片段,22 ℃孵育2 h。将连接产物在42 ℃水浴中化学转化至DH5α感受态细胞中,取适量已转化的感受态细胞涂抹于含50 μg·mL-1氨苄西林的LB平板上,37 ℃培养16 h。挑选出阳性克隆菌落继续培养16 h,提取质粒,吸取200 μL阳性克隆对应的菌液用于测序,将测序结果与目的基因序列进行比对。无突变的克隆命名为ADV6-VDAC1病毒质粒。

1.2.2 病毒包装

常规接种5000个293A细胞至6 cm培养皿中,培养箱(37 ℃,5% CO2)孵育过夜。按感染复数(MOI)=100加入ADV6-VDAC1病毒质粒至0.5 mL无血清DMEM培养基中混匀,并将30 μL RNAi-Mate加至0.5 mL无血清DMEM培养基中,充分混匀,室温静置5 min,再将两种混合液混合均匀,室温放置20 min左右。将转染混合物均匀加入6 cm培养皿中,充分摇晃培养皿以充分混匀复合物,培养箱孵育4～6 h后更换为含10%FBS的完全培养基,出现空斑后收集病毒裂解原液。

“我骗杰克说我要把瓷瓶送给朋友，可是他一点儿也不好糊弄。为了不被发现，我就把现场伪造成我和杰克都被绑架的样子。”教授苦笑着说道，“我本想等把这个瓷瓶卖了换些钱之后，就把杰克放了，然后出去躲一段时间……”

1.2.3 病毒的扩增和纯化

第一轮扩增:在直径为10 cm的培养皿中接种适量293A细胞,使用含有10% FBS的DMEM培养液,在37℃、5% CO2的条件下培养。当细胞密度达到80%左右时,添加适量病毒上清液感染细胞进行病毒扩增。待大部分293A细胞出现典型的空斑,并且有50%的细胞脱壁时,进行低速离心以收集细胞。随后,将细胞在2 mL DMEM中悬浮,进行-70 ℃/37 ℃的反复冻融,振荡3次。在4 ℃条件下,以7000 g的速度进行离心5 min,将病毒上清液收集并保存于-70 ℃。使用相同的步骤进行第二轮扩增,将病毒上清液收集并保存于-70 ℃。

重组腺病毒的纯化:按照腺病毒Maxi纯化试剂盒的说明书进行腺病毒的纯化。最终,将纯化后的重组腺病毒分装,并保存于-70 ℃。

1.2.4 大鼠H9c2心肌样细胞的培养及传代

于每个10 cm培养皿中接种5×105个H9c2细胞,加入7 mL含10% FBS的高糖DMEM培养基,置入培养箱(37 ℃,5% CO2)培养,次日更换培养基。细胞密度达80%左右时进行传代,次日更换培养基。取第6代H9c2细胞进行后续实验。

1.2.5 ADV6-VDAC1腺病毒的功能鉴定

将H9c2细胞传代至六孔板,密度为5×104个·孔-1。实验分组:Control组(正常H9c2心肌细胞),ADV6-NC组(转染ADV6-NC腺病毒),ADV6-VDAC1组(转染ADV6-VDAC1腺病毒)。每孔各加入无血清高糖DMEM培养基1 mL,再按实验分组分别加入DMEM 50 μL、ADV6-NC腺病毒50 μL,ADV6-VDAC1 108腺病毒50 μL,24 h后更换为含血清的完全培养基,72 h后收集细胞,分别提取总RNA及蛋白。

1.2.6 总RNA提取及qPCR

各组细胞以预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,吸除液体后加入1 mL Trizol,提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,进行qPCR检测VDAC1 mRNA的表达情况。

1.2.7 细胞蛋白提取及蛋白免疫印迹

各组细胞以预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,于每1 mL的RIPA裂解液加入10 μL 100 mM 苯甲基磺酰氟(PMSF)配制成裂解工作液,充分混匀。每个培养皿中加入200 μL上述裂解液,混匀后于冰上孵育15～20 min。将混悬液移至4 ℃预冷的1.5 mL离心管中,4 ℃下以12 000 rpm离心15 min,吸取上清至4 ℃预冷的1.5 mL离心管中,吸取20 μL进行BCA法蛋白浓度测定,于-80 ℃保存。

配置10%分离胶和5%浓缩胶,上样后以80 V的恒定电压电泳,直至浓缩胶表面平整,然后调整电压至120 V,直至溴酚蓝指示剂出现。停止电泳后,将事先在甲醇中激活的PVDF膜贴在胶上,以220 mA的电流进行1 h转膜。将PVDF膜放入含有5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中进行1 h封闭。封闭后,进行一抗的孵育,并4 ℃过夜。用TBST洗膜3次,每次10 min。在室温下进行二抗孵育1 h,再次洗膜后,使用荧光化学发光凝胶成像系统进行显影。

2 结果

2.1 腺病毒质粒构建

VDAC1(大鼠)基因上下游引物分别加上EcoRI和BamHI酶切序列及保护碱基,用于载体的亚克隆,引物序列见表1。通过PCR获取VDAC1目的基因,长度为900 bp,插入到ADV6(CMV)质粒载体,插入位点为EcoRI和BamHI,见图1。测序结果和NCBI中的目的cDNA序列比对完全一致,证明病毒质粒构建成功,见图2。

图1 ADV6-CMV质粒图谱

图2 VDAC1基因的部分序列

表1 引物序列

2.2 ADV6-VDAC1包装、收毒、扩增及滴度测定

ADV6-VDAC1病毒质粒感染293A细胞后,每天定时观察病毒增殖情况,待开始出现空斑现象时,收集病毒裂解原液,采用微量全细胞病变法检测病毒滴度,结果为1×1011PFU·mL-1,体积为1 mL。

2.3 ADV6-VDAC1腺病毒功能鉴定

ADV6-VDAC1转染H9c2心肌细胞72 h后,分别提取各实验组细胞的RNA及总蛋白,进行qPCR及蛋白免疫印迹实验,分别检测VDC1 mRNA及蛋白表达水平。结果显示,ADV6-VDAC1组VDAC1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.01),提示ADV6-VDAC1腺病毒构建成功,可在H9c2细胞内正常表达,见图3。

A:qPCR检测VDAC1 mRNA表达水平;B:蛋白免疫印迹检测VDAC1蛋白表达水平;C:VDAC1蛋白印迹灰度分析。ns:P>0.05,**P<0.01。图3 转染细胞VDAC1表达水平

3 讨论

VDAC在线粒体中存在3种亚型(VDAC1、VDAC2和VDAC3),其中VDAC1的表达最为广泛[8]。VDAC1由19条跨膜β-链和一个N末端α-螺旋结构域组成,位于线粒体外膜,使其能够与100多种蛋白质相互作用,并通过多个信号通路协调线粒体和细胞的相互作用[9-10]。有研究[11]表明,VDAC1是一种多功能蛋白,在物质运输、信号转导、能量产生、细胞凋亡等多个生理过程中发挥着关键作用。此外,有研究[11]报道线粒体通透性转换孔道(MPTP)的开放或关闭状态与心肌缺血再灌注损伤密切相关,其中VDAC1在这一过程中发挥了关键的调节作用。本课题组之前的研究[7]表明,心肌缺血预适应可以抑制VDAC1的表达,维持线粒体膜电位,从而关闭MPTP的开放状态,最终抑制心肌细胞凋亡,发挥抗缺氧/复氧损伤的作用。因此,为深入研究VDAC1在心肌缺血再灌注损伤中的具体作用机制,本研究利用基因表达调控技术构建了腺病毒过表达载体,在H9c2细胞中特异性激活VDAC1表达,以探讨VDAC1在心肌损伤中的作用机制。

病毒作为自然演化的载体,是工程病毒载体系统传递治疗基因的理想选择,能够高效地将外源基因传递到宿主细胞中。由于其强大的携带外源基因的能力和高效表达的特性,病毒常被广泛应用于基因工程,作为基因传递的载体[12]。腺病毒属于腺病毒科,是一种非包膜病毒,能够快速侵入细胞,并在细胞核中进行复制,但通常不会整合到宿主细胞基因组中。腺病毒在体内传递基因的效果非常显著,也可应用于癌症治疗,旨在诱导免疫对抗癌症或直接杀死癌细胞,同时用于评估病毒衣壳修饰是否有助于增强治疗特性[13]。重组腺病毒已被广泛用于基因工程,包括外源基因传递、体内疫苗接种和基因治疗等方面。例如,腺病毒可将外源性基因传递至各种细胞类型,而这种基因传递并不依赖于细胞的分裂,因此可获得高滴度的病毒和高水平的转基因表达[14]。

本研究首先采用腺病毒载体系统构建了VDAC1病毒质粒,然后将其感染至293A细胞中进行病毒包装、扩增和纯化。经过病毒滴度测定后,再感染H9c2心肌细胞,通过qPCR和蛋白免疫印迹检测VDAC1 mRNA及蛋白的表达,以确保ADV6-VDAC1腺病毒的成功构建且能在心肌细胞中正常表达,为深入研究VDAC1在心肌缺血再灌注损伤中的作用提供了前期条件。