硒化合物基于靶标TrxR 抑制脑胶质瘤生长的分子机制研究

郝丕达 苏冉 谢浩博 李玉花 王维清 赵晓娟 范存东

在全球范围内, 癌症的负担日益加重, 已成为威胁人类健康的主要疾病之一。根据2010 年世界卫生组织的数据, 癌症的死亡率已超过心脏病, 成为全球死亡的首要原因, 其中每8 个死者中就有1 人死于恶性肿瘤［1］。脑胶质瘤作为最常见的恶性脑肿瘤, 其治疗仍然是当前医学研究的一个重大挑战。近年来, 靶向药物治疗已经迅速发展, 成为肿瘤治疗领域的主要研究方向和药物类别, 其在全球肿瘤药物市场的份额已经达到了40%［1］。这一发展趋势的背后是分子生物学和细胞生物学的快速进展, 提供了大量的潜在药物靶点,如细胞生长因子、蛋白激酶和细胞周期调节因子等［2］。同时, 化学合成技术、晶体衍射技术、分子模拟、高通量筛选技术和计算机辅助药物设计等先进技术的运用, 也为靶向药物的开发提供了有力支持。尽管如此,癌症的发病机制复杂多样, 靶向药物在临床应用中也面临着耐药性、剂量依赖性毒性和胃肠道不良反应等问题［3］。因此, 开发高效低毒的靶向抗癌药物, 仍然需要在细胞信号转导的多个通路和靶标上进行深入研究。硒作为一种对人类和动物都必需的微量元素, 其在抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖等多个生物学过程中发挥着重要作用［4］。硒化合物在癌症防治中的作用已经得到了广泛的研究验证, 无论是流行病学研究, 还是临床前和临床干预研究, 都证实了硒在癌症预防和治疗中的潜在价值。本研究着重探讨硒化合物通过靶向硫氧还蛋白氧化还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)抑制脑胶质瘤生长的分子机制, 希望为开发新型、高效低毒的靶向抗癌药物提供理论基础和实验依据。本研究使用人类恶性胶质瘤细胞系U251 和U87 作为实验模型, 采用不同浓度的硒化合物进行处理, 并运用Western blot 技术和流式细胞分析技术, 深入分析硒化合物对TrxR 蛋白表达及其下游凋亡信号通路的影响。通过这一系列的实验探索, 期望能够揭示硒化合物抑制脑胶质瘤生长的分子机制, 为靶向治疗提供新的策略和方法。

1 材料与方法

1.1 材料 选择U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞、癌旁组织细胞作为研究对象, 将人恶性胶质瘤细胞纳入观察组, 癌旁组织细胞纳入对照组, 以不同浓度的硒化合物处理U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞一定时间。

1.2 方法

1.2.1 细胞活性检测 在细胞活性检测实验中, 选用了几种不同类型的肿瘤细胞系进行培养, 确保细胞处于良好的生长状态。细胞分为多组, 分别用不同浓度(0、10、20、50、100 μM)的硒化合物处理, 并设立对照组不添加硒化合物。处理时间设定为24 h, 以观察硒化合物对细胞活性的影响。之后, 使用四唑盐(MTT)比色法检测细胞活性, 将MTT 溶液添加到每个细胞培养板中, 继续培养4 h, 使MTT 能够被活细胞中的脱氢酶还原, 形成可溶解的紫色甲晶石沉淀。随后添加二甲基亚砜(DMSO)溶剂, 充分溶解甲晶石沉淀, 并使用酶标仪测定吸光度, 从而计算出细胞活性。通过这一系列实验, 能够筛选出对硒化合物响应最敏感的肿瘤细胞系, 为后续研究提供基础。

1.2.2 TrxR 蛋白的表达 在研究硒化合物对TrxR 蛋白表达的影响时, 选用了U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞作为实验材料。细胞分为多组, 分别用不同浓度(0、10、20、50、100 μM)的硒化合物处理, 处理时间分别设定为24 h 和48 h。处理后, 提取细胞中的蛋白质,并使用Bradford 法确定蛋白质浓度。随后, 将蛋白样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳, 并转移到硝酸纤维素膜(NC 膜)上。使用5%脱脂奶粉封闭膜, 然后用抗TrxR 的一抗孵育, 再用相应的二抗孵育。通过增强化学发光法(ECL)显影系统检测信号, 并使用ImageJ 等软件进行分析, 从而了解硒化合物对TrxR 蛋白表达的剂量效应和时间效应。

1.2.3 ROS 变化和DNA 断裂检测 在观察硒化合物对细胞ROS 水平和DNA 断裂的影响时, 将细胞分为多组, 分别用不同浓度(0、10、20、50、100 μM)的硒化合物处理。使用2', 7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)作为探针, 检测细胞内ROS 的水平, 并通过流式细胞仪进行分析, 得到ROS 水平的变化情况。同时, 使用原位末端凋亡法(TUNEL)技术标记细胞内断裂的DNA,观察细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法 为了确保实验结果的可靠性, 所有实验都至少重复3 次, 结果以均数±标准差(±s)表示。利用SPSS26.0 等统计学软件进行统计学分析, 两组之间利用双尾检验, 多组之间利用多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组TrxR 蛋白的表达水平比较 观察组U251、U87 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白表达水平较对照组高,差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 两组TrxR 蛋白的表达水平比较( ±s, ng/ml)

表1 两组TrxR 蛋白的表达水平比较( ±s, ng/ml)

注：与对照组比较, aP<0.05

组别 TrxR 蛋白 U87 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白U251 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白观察组 26.78±2.06a 26.92±2.14a 26.76±2.32a对照组 1.09±0.21 t 24.566 24.824 24.746 P<0.001 <0.001 <0.001

2.2 SeC、MeSe、SeMe 对观察组细胞活性的影响随着SeC、MeSe、SeMe 浓度的升高, U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞活性逐渐下降。见表2, 表3, 表4。

表2 SeC 对U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞活性的影响(%)

表3 MeSe 对U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞活性的影响(%)

表4 SeMe 对U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞活性的影响(%)

2.3 SeC、MeSe、SeMe 对观察组细胞TrxR 蛋白表达水平的影响 与干预前相比, 经过SeC、MeSe、SeMe干预后, U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞组织中TrxR蛋白表达下降, 差异有统计学意义(P<0.001)。见表5,表6。

表5 SeC、MeSe、SeMe 对U251 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白表达水平的影响( ±s, ng/ml)

表5 SeC、MeSe、SeMe 对U251 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白表达水平的影响( ±s, ng/ml)

注：与干预前比较, aP<0.05

时间 SeC MeSe SeMe干预前 26.76±2.32干预后 20.19±3.70a 20.89±3.58a 20.89±2.58a t 8.154 8.224 8.146 P<0.001 <0.001 <0.001

表6 SeC、MeSe、SeMe 对U87 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白表达水平的影响( ±s, ng/ml)

表6 SeC、MeSe、SeMe 对U87 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白表达水平的影响( ±s, ng/ml)

注：与干预前比较, aP<0.05

时间 SeC MeSe SeMe干预前 26.92±2.14干预后 20.89±3.14a 21.09±3.47a 20.96±3.48a t 8.548 8.425 8.236 P<0.001 <0.001 <0.001

2.4 SeC、MeSe、SeMe 对观察组细胞组织中ROS表达水平的影响 与干预前相比, 经过SeC、MeSe、SeMe 干预后, U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞组织中ROS 表达水平升高, 差异有统计学意义(P<0.001)。见表7, 表8。

表7 SeC、MeSe、SeMe 对U251 人恶性胶质瘤细胞组织中ROS 表达的影响( ±s, U/ml)

表7 SeC、MeSe、SeMe 对U251 人恶性胶质瘤细胞组织中ROS 表达的影响( ±s, U/ml)

注：与干预前比较, aP<0.05

时间 SeC MeSe SeMe干预前 832.76±30.32干预后 1097.23±54.76a 1001.84±54.54a 1096.89±54.58a t 78.224 80.598 79.36 P<0.001 <0.001 <0.001

表8 SeC、MeSe、SeMe 对U87 人恶性胶质瘤细胞组织中ROS 表达的影响( ±s, ng/ml)

表8 SeC、MeSe、SeMe 对U87 人恶性胶质瘤细胞组织中ROS 表达的影响( ±s, ng/ml)

注：与干预前比较, aP<0.05

时间 SeC MeSe SeMe干预前 839.76±42.47干预后 1065.89±54.65a 1046.09±54.12a 1096.96±54.48a t 78.561 78.862 78.645 P<0.001 <0.001 <0.001

3 讨论

肿瘤的恶性生长对人类健康构成了巨大威胁, 其中脑胶质瘤作为一种高发的恶性肿瘤, 其治疗一直是医学领域研究的热点。从本研究的结果来看, 观察组U251、U87 人恶性胶质瘤细胞TrxR 蛋白表达水平较对照组高, 差异有统计学意义(P<0.001)；且随着硒化合物浓度的增加, U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞活性逐渐下降；与干预前相比, 经过SeC、MeSe、SeMe 干预后,U251 和U87 人恶性胶质瘤细胞组织中ROS 表达水平升高, 差异有统计学意义(P<0.001)。这一结果表明,硒化合物可能通过抑制TrxR 蛋白的活性, 增加细胞内ROS 的水平, 从而诱导脑胶质瘤细胞的凋亡, 抑制肿瘤的生长。这为临床提供了一种新的靶向治疗策略, 即通过靶向TrxR 蛋白, 调节细胞内ROS 的水平, 达到抑制肿瘤生长的目的。这一发现不仅丰富了对脑胶质瘤治疗机制的认识, 也为开发新型抗肿瘤药物提供了新的研究方向［5］。

值得注意的是, 尽管本研究的结果在一定程度上验证了硒化合物通过靶向TrxR 蛋白抑制脑胶质瘤生长的分子机制, 但仍需要进一步的实验验证和深入研究。未来的研究可以从硒化合物的剂量效应、时间效应以及与其他抗肿瘤药物的联用效应等方面进行深入探讨,以期为临床应用提供更加全面和准确的理论依据和实验数据支持。

硫氧还蛋白系统是除谷胱甘肽和超氧化物歧化酶之外的另一内源性抗氧化系统, 由 TrxR、天然底物硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)组成, 是一种NADPH 依赖的包含FAD 结构域的二聚体硒酶, 属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员, 其主要功能是利用NADPH 催化小分子蛋白 Trx 上的-S2还原成(-SH)2的反应, 即维持Trx 的还原型(见图1)［6］。随着对TrxR 深入研究发现, 其N-端的FAD 结构域有一个保守的氧化还原活性中心-Cys-Val-Asn-Val-Gly-Cys-, 在C-末端含有由硒半胱氨酸和半胱氨酸构成的活性中心-Gly-Cys-Sec-Gly-。由于处于还原态的C-端氧化还原活性中心Cys 和SeCys 残基具有很强的亲核性, 因此TrxR 可以催化还原多种底物或配体。除Trx 外许多内生的和外来的化合物, 如维生素K3、硫辛酸、5, 5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和四氧嘧啶、磷脂氢过氧化物等, 都可被TrxR 还原。因此TrxR 在机体氧化还原调节和抗氧化防御中起着重要的作用［7］。由于临床上70%的癌症发生与细胞凋亡失控有关, 利用凋亡调控机制寻找高效低毒、作用机制明确的凋亡诱导剂已成为肿瘤防治的一个重要策略［8］。当前临床上常规使用的化疗药物基本上都是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而达到治疗的目的。

图1 硫氧还蛋白系统氧化还原循环

硒化合物作为一类具有抗肿瘤潜力的化合物, 其通过多种机制抑制肿瘤生长。硒化合物不仅能提升细胞内谷胱甘肽水平, 减轻氧化应激, 还能通过抑制与氧化应激相关的信号通路, 如核因子κB(NF-κB)和Nrf2 等, 从而抑制肿瘤生长。此外, 硒化合物还能通过激活细胞凋亡途径, 影响细胞凋亡相关蛋白的表达, 抑制细胞增殖并阻断肿瘤细胞的生长过程。硒化合物还能抑制肿瘤微血管的形成, 切断肿瘤的营养供应［9-12］。这些机制共同作用, 使硒化合物成为抑制肿瘤生长的有力工具。TrxR 作为调节细胞内氧化还原平衡的关键分子, 已被证实其能有效抑制多种肿瘤的生长［13-15］。TrxR 已成为国际上高度关注的新型抗肿瘤靶标。本研究团队发现, 有机硒化合物能够通过诱导ROS 产生, 引发脑胶质瘤细胞的凋亡, 但ROS 的产生机制尚需进一步探究。

硒化合物作为一类具有抗肿瘤潜力的化合物, 在本研究中显示了通过靶向TrxR 抑制脑胶质瘤生长的分子机制。研究结果表明, 硒化合物能够显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖和迁移, 诱导细胞凋亡［16-18］。这一发现为硒化合物在脑胶质瘤治疗中的应用提供了理论依据, 并为未来的临床治疗提供了新的方向。通过抑制TrxR 的活性, 硒化合物导致细胞内氧化还原状态的失衡, 这一改变直接影响到脑胶质瘤细胞的正常功能, 抑制其生长。同时, 硒化合物还通过调节线粒体相关蛋白的表达, 激活细胞凋亡途径, 进一步促进脑胶质瘤细胞的死亡［19,20］。

总之, 本研究揭示了硒化合物通过靶向TrxR 抑制脑胶质瘤生长的分子机制, 为硒化合物在肿瘤治疗中的应用提供了新的理论依据和实验数据支持。这些发现对于开发新型抗肿瘤药物, 提供更多治疗肿瘤的选择具有重要意义。本研究通过对脑胶质瘤组织中TrxR和ROS 的表达进行分析, 探讨了硒化合物对脑胶质瘤的影响。结果显示, 硒化合物可能通过抑制TrxR 蛋白的活性增加细胞内ROS 的水平, 从而诱导脑胶质瘤细胞的凋亡, 抑制肿瘤的生长, 这为硒化合物在脑胶质瘤治疗中的应用提供了一定的实验依据, 也为未来基于TrxR 靶向的抗肿瘤药物的研发和应用提供了新的思路和方向。