血清淀粉样蛋白A在新生儿败血症、坏死性小肠结肠炎早期诊断中的价值

宋思捷,钟晓云

(1.重庆医科大学附属妇女儿童医院儿科,重庆 401147; 2.重庆市妇幼保健院新生儿科,重庆 401147; 3.重庆市妇幼保健院围产医学中心,重庆 401147)

由于抗菌药物围产期预防性使用,新生儿败血症较过去减少[1],但仍是新生儿主要死因之一,发病率为0.5‰～9.7‰,病死率为9%～24.4%[1-4]。新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是一种机制尚未阐明的肠道疾病,常伴细菌感染,其所致肠穿孔、腹膜炎等是新生儿不良预后主要原因,因此早期诊治非常重要。新生儿败血症和NEC的早期临床表现无特异性,诊断困难。血培养是诊断败血症的金标准,但一般需2 d才可获取结果,且阳性率较低[5]。一些非特异性实验室检查,如急性期反应物[acute phase reactant,APR,如C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)]、白细胞介素(interlukin,IL)-6、IL-8和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-a)等,常用于此两种疾病的临床诊断。但CRP在感染早期有明显滞后性[5-6],细胞因子半衰期均较短,在感染12～24 h后即明显降低,增加假阴性率,导致漏诊和误诊[6-7]。降钙素原(procalcitonin,PCT)是细菌感染早期标志物,亦被作为常用指标之一,但其在新生儿早发型败血症(early-onset sepsis,EOS)中的诊断价值低于CRP,且因其在新生儿生后几天内有生理性升高,影响其对EOS的诊断[6]。中性粒细胞表面CD64分子诊断感染性疾病敏感性较高[8],但因检验方法特殊尚未普及。以上标记物筛查组合对于败血症、NEC有一定诊断价值,但阳性预测值仍然不高[5]。因此,目前怀疑败血症和(或)NEC的新生儿是否开始抗菌药物治疗及何时停止,对于临床医生仍是难题。

血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)亦是一种APR,在感染、外伤、缺血性损伤等疾病中有相关研究[9-11],SAA在新生儿败血症、NEC中早期即明显升高,且能反映疾病严重程度和治疗效果,可作为新生儿败血症、NEC等细菌性感染早期诊断非特异性指标之一。本文就SAA及其在新生儿败血症和NEC早期诊断中的价值进行综述。

1 SAA概述

1.1 SAA基因及转录 编码人SAA基因位于11号染色体短臂(11p15.1),其基因家族包含SAA1、SAA2、SAA3和SAA4四种基因[11]。SAA1和SAA2基因被称为“急性期SAA”基因,其启动子区域含有核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和IL-6转录因子识别序列,能够被IL-1β、IL-6和TNF诱导激活,编码机体急性期反应时分泌的SAA,即急性期反应物SAA(acute phase reactant serum amyloid A,A-SAA)。SAA 3基因编码的第43个密码子为翻译终止信号,故不能编码蛋白。SAA4基因属于结构基因,编码蛋白为结构性SAA(constitutive SAA,C-SAA),是高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)成分之一。C-SAA蛋白在机体急性期反应时保持稳定水平。

A-SAA基因转录主要由细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和细胞因子(IL-6、IL-1、TNF-α等)诱导[11],这些配体结合膜受体后激活转录因子NF-IL6,诱导A-SAA基因转录。此外,A-SAA基因转录可以通过自身产物A-SAA激活TLR2/4信号通路,正反馈促进A-SAA蛋白合成。

1.2 SAA生物学功能 SAA是一种急性期反应淀粉样变前体蛋白,含有104个氨基酸,分子量为11.5 kDa,受到刺激后在肝脏和肾脏迅速合成,血液中水平可增加100～1 000倍[11]。SAA生物学功能主要为:(1)参与炎症反应。在炎症反应中能募集免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞等到靶组织,抵抗病原体入侵或应激[10,12]。诸多促/抗炎症因子亦与SAA合成有关,因此SAA在调节炎症反应中起着关键作用[10]。(2)参与固有免疫反应。SAA可直接结合革兰阴性细菌,在这些细菌外膜蛋白A中可找到SAA的成分[11]。SAA与细菌结合后作为调理素发挥作用,促进免疫细胞吞噬细菌,促进TNF-α、IL-10合成增加等[11]。SAA在正常浓度下可发挥上述作用,提示其可作为一种模式识别蛋白,参与机体固有免疫。(3)参与脂质代谢。SAA也是一种参与脂质代谢的载脂蛋白。在急性期反应时,SAA通过取代载脂蛋白A-1来部分重塑HDL。与SAA结合的HDL,其代谢途径从经典HDL胆固醇代谢逆运输转变为胆固醇循环途径,利于细胞修复[13]。(4)影响血管生成。当SAA浓度达到10～60 μg/mL时,其可作为血管生成蛋白发挥作用,刺激内皮细胞增殖、黏附,新血管形成[14]。

2 SAA在炎症反应中的作用

2.1 促进炎症因子分泌及炎症调节作用 SAA在炎症反应中最重要作用是诱导IL-1β的前体pro-IL-1β合成,并激活NRLP3炎症小体[15]。NRLP3是目前研究最多的炎症小体,是细胞内炎症反应主要开关,其作用是将pro-IL-1β转化为生物活性形式IL-1β[16]。SAA能促进主要促炎免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞等)分泌成熟的IL-1β;SAA同时亦诱导其他促炎细胞因子,如IL-1α、IL-6等产生[17]。SAA诱导促炎细胞因子机制主要是激活TLR2/TLR4及NRLP3信号通路[11]。通过抑制TLR2/4受体,SAA促炎症作用被明显抑制;而通过沉默NRLP3基因或抑制caspase-1,SAA则失去促进IL-1β分泌的作用[18]。

SAA调节炎症作用表现为:一方面为抗炎作用,较低浓度SAA(0.1 μg/mL)可抑制中性粒细胞氧化爆发;但另一方面,高浓度(50 μg/mL)则可以刺激中性粒细胞氧化爆发[19-20]。提示在正常或病理状态时,SAA能表现出不同功能,促进或抑制中性粒细胞炎症反应。

2.2 趋化作用 SAA另一个重要促炎活性是其趋化作用,它能刺激免疫细胞等定向迁移[10,12]。不同细胞对SAA趋化作用的敏感性不同,单核和未成熟树突状细胞对SAA刺激较敏感,SAA浓度在12.5～100 ng/mL即可发挥作用;而中性粒细胞则需1 000 ng/mL的浓度[21-22]。SAA还可以自分泌方式增强单核细胞迁移,以旁分泌方式通过TLR2通路增强中性粒细胞迁移[19-20]。体内试验亦证实给小鼠皮下注射SAA[10或50 μg/d,或3 μg/(d·只)],48、72 h后可引起中性粒细胞/单核细胞局部募集,5 d达高峰[11,23]。

3 SAA在新生儿EOS中的诊断价值

我国最新新生儿败血症诊断及治疗专家共识将EOS定义为发病时间≤3日龄,晚发型败血症(late-onset sepsis,LOS)为发病时间>3日龄[5]。

SAA在全身性感染早期即可升高,敏感性高,且持续时间长,容易被监测,因此被认为是新生儿败血症诊疗中较有前景的生物标志物。Liberatori等[24]测定了8例EOS早产儿及足月儿血SAA水平,发现SAA升高幅度、峰值等均符合APR预期。Arnon等[25]共纳入104例时龄<72 h足月儿,在怀疑EOS后测定SAA、CRP、I/T水平,结果显示EOS组SAA水平在0、24、48 h均高于非EOS组,24 h为高峰;而CRP在0 h时两组比较差异无统计学意义,在24、48 h才出现显著差异。0 h时SAA曲线下面积(area under curve,AUC)高于CRP(0.987 VS 0.843),最佳截断值为8 mg/L。与CRP相比,SAA升高幅度更明显,经治疗后下降亦更快。该研究提示SAA在EOS早期诊断价值较高,且可反映治疗效果,可作为早期诊断EOS的指标之一;而CRP反应滞后,不利于EOS早期诊断。

一篇Meta分析[26]纳入9项研究、共823例新生儿,结果显示在败血症临床症状出现前,0 h及8～96 h后,SAA均有较高诊断价值;总体上SAA检验准确性高于CRP,0 h时SAA合并灵敏度为0.84、合并特异度为0.89,与国内一项最新Meta分析[27]的研究结论相似。此外,联合检测SAA、PCT、CRP有较高诊断价值(灵敏度92%),值得临床应用[28]。但三篇文献未区分是EOS还是LOS。

国内外目前均无SAA对早产儿EOS诊断价值的报道。本课题组纳入了500余例早产儿,结果显示SAA在生后24 h内早期诊断早产儿EOS的敏感性高于CRP(未发表数据)。SAA另一大优势是无需额外采血(可与末梢血常规一起)、减少医源性失血,可能更适用于早产儿,特别是极/超低出生体重儿EOS诊断。

此外,Mithal等[29]发现血培养阳性EOS新生儿脐血SAA水平明显升高,可用于感染高危因素监测。SAA不通过胎盘,因此生后增高是新生儿体内自身合成的内源性产物,而非来源于母体[25,30]。

4 SAA在新生儿LOS中的诊断价值

新生儿LOS因临床表现不典型,易致误/漏诊、抗菌药物使用不合理等。LOS常为医院感染,病情较重、病死率高,在早产儿、低出生体重儿中发病率更高[5]。因此能早期甄别LOS新生儿对于临床医生医疗决策非常重要。

在早产儿中,Arnon等[31]发现SAA在LOS组中升高,在革兰阴性菌LOS中升高更明显;与CRP、WBC、I/T相比,SAA灵敏度(100%)、特异度(93%)和阳性预测值(positive predictive value,PPV,96%)均最高。然而该研究局限性在于未进行动态性评估。因此,该课题组进一步研究了SAA在LOS时的动态变化[32],发现SAA在早产儿LOS组中0、8 h即升高,而CRP在24 h才升高,IL-6仅在0 h时升高。通过治疗,SAA较CRP更快恢复正常,与前述EOS研究结论一致。SAA在0、8 h时AUC最大[0.81(0.49,0.97)],高于CRP[0.62(0.39,0.89)]和IL-6[0.65(0.35,0.76)],最佳截断值为10 mg/L。此外,SAA在早产儿暴发性LOS(发病后3 d内死亡)尚未出现临床症状前升高[32-33]。我国汪盈等[34]在极低出生体重儿LOS中发现,SAA在0 h时较CD64、CRP灵敏度高,为83.8%。上述研究均显示出SAA在早产儿LOS早期诊断中的优势。

对于足月儿,SAA在LOS组0 h、1 d、3 d时高于对照组(均P<0.001),0 h时SAA诊断LOS的AUC值为0.929[35];当SAA切割值为11.3 mg/L时,灵敏度为78%,特异度为100%。血培养阳性LOS组SAA水平高于临床LOS组[35],而前述早产儿LOS中未得出此结论[32]。可能与早产儿及足月儿感染时免疫应答能力不同,或是与细菌谱不同有关,亦可能是样本量影响。

综上所述,SAA在早产及足月儿LOS中早期诊断价值强于CRP、IL-6,可作为非特异性指标之一,早期甄别出LOS新生儿,积极治疗,改善预后。但目前相关高质量临床研究较少,不同研究结论有差异,尚需更多大样本、高质量、多中心临床研究来证实SAA在LOS早期诊断中的价值。

我国妇幼保健协会临床诊断与实验医学分会关于SAA在儿童感染性疾病最新专家共识中指出SAA是新生儿败血症诊断和预后随访的敏感指标[36]。SAA联合CRP对细菌感染的早期诊断效能价值优于单项指标检测;若SAA和CRP水平均显著升高,则提示细菌感染可能性大[36],值得用于新生儿败血症的临床监测。PCT是我国新生儿败血症诊疗共识推荐指标[5],但目前国内外均无比较PCT与SAA在新生儿败血症早期诊断价值的研究,可考虑在未来进行相关研究。

5 SAA与NEC

5.1 血SAA在NEC中的诊断价值 NEC严重威胁新生儿生命,机制尚未阐明,与早产、感染、肠道缺血缺氧等有关。其所致肠穿孔、腹膜炎、短肠综合征等是新生儿死亡、致残的主要原因,因此早期诊治非常重要。我国2021年最新NEC临床诊疗指南推荐CRP、PCT、IL-6等炎症指标用于NEC诊断和治疗效果监测[37]。

Cetinkaya等[38]发现血SAA在早产儿NEC组0、24、48 h时升高,且NEC Ⅱ/Ⅲ期血SAA水平高于Ⅰ期(P=0.018)[39-40];血SAA水平与NEC影像学Bell分期、CRP/IL-6水平亦明显相关。因此血SAA可作为NEC早期诊断标记,对NEC分度也有预测价值。2010年香港中文大学Ng等[41]通过蛋白质组学方法发现,在NEC和LOS中SAA是最有价值的生物标志物之一。目前内地尚无评价SAA在NEC中诊断价值的临床研究,本课题组分析了近1年内NEC新生儿的临床资料,发现SAA在NEC Ⅰ～Ⅲ期新生儿中均增高,早期敏感性高于CRP(未发表数据)。

5.2 尿SAA在NEC中的诊断价值 鉴于早产儿特别是极/超低出生体重儿血容量少,采血过多可致医源性贫血[42],且增加痛苦感受。因此,一些学者期望通过无创的方法预测和诊断NEC。SAA分子量较小,仅11.5 kDa,可经过尿代谢,可以作为无创监测指标之一。

研究[43-44]发现尿SAA在重度NEC组(定义为需手术治疗或Bell Ⅲ期)中升高,且NEC外科组高于非外科组(P=0.007),NEC Ⅲ期组高于Ⅱ期组(P=0.010)。区别外科NEC与非外科NEC组尿SAA临界值为34.4 ng/mL(灵敏度83%、特异度83%)。虽两项研究样本量较小,但仍提示尿SAA可以作为判断NEC程度的无创监测指标之一。目前国外尿SAA与NEC相关研究及样本量均较少,而国内尚无研究,但因其无创优势,在早产儿、特别是极/超低出生体重儿NEC诊断、预后判断中可能有较好应用前景,可作为未来NEC研究方向之一。

6 SAA的检测方法

现有SAA检测方法均基于免疫学,如放射免疫分析法、放射免疫扩散法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫比浊法和免疫散射比浊法等[11]。其中后两种检测法为全自动方法,且不需额外采血、可与血常规一起进行,因其便利性已逐步应用于临床检验科;但检测低限为3.3～5 mg/L,敏感性稍低。前三种方法因放射性、耗时等缺点,主要用于科研实验室;但检测低限可达0.2 μg/L,甚至达ng水平,灵敏度高,目前市场上已有试剂盒供应。目前所有SAA检测方法均使用多克隆抗体,故检测的是血中总SAA水平,不能区分SAA亚型。

7 总结

据目前研究结论,SAA与其他常用标志物(CRP、PCT)比较有以下特点:(1)SAA较CRP敏感,早期即可显著升高[25-26]。(2)尚无研究比较SAA与PCT在新生儿败血症早期诊断中的价值。SAA和PCT在NEC诊断中均是较敏感和可靠的指标[40],但SAA较PCT价格低廉数倍,且可与血常规一起进行检测(末梢血),不增加额外采血量。(3)SAA升高幅度可反映疾病严重程度,动态监测可反映治疗效果[29,38-39]。(4)SAA可经尿代谢,可以成为新生儿败血症、NEC无创监测指标之一[43-44]。

虽然SAA在EOS/LOS、NEC早期诊断中有一定价值,但仍有局限性:(1)因SAA在外伤、缺血性损伤、病毒感染等时亦可增高[9-11],会降低其在EOS/LOS及NEC诊断中的特异度。(2)SAA敏感性较高,若诊断临界值设置较低,可能会带来不必要的抗菌药物使用增加和使用时间延长,建议与CRP或其他标志物联用[36]。(3)鉴于EOS/LOS诊断标准在不同国家或中心有差异,故本综述所提及不同研究中EOS/LOS诊断标准可能存在异质性,实际应用时需加以区分。

综上所述,SAA在新生儿败血症、NEC中早期即明显升高,诊断准确性优于CRP、PCT、IL-6等常用炎症指标,可以用于早期临床诊断、随访及预后评估。但目前国内外高质量临床研究较少,上述研究纳入病例数亦较少,尚需更多大样本、高质量研究论证SAA在上述疾病中的诊断价值。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。