CD4+和CD8+T细胞在结核病免疫应答中的作用

温淑芳 魏荣荣 李浩然 刘毅

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)作为一种胞内病原体,主要通过飞沫传播侵入人体引起结核病[1]。据最新的WHO报道指出,2022年全球结核病死亡数为130万例,是仅次于新型冠状病毒感染的世界第二大单一传染源死因[2]。全球约有1060万例新发结核病患者,130万例死于结核病,但长期的流行病学研究发现,仅5%～10%的MTB感染者会进展为活动性结核病患者,在大多数情况下,受感染的个体在其整个生命过程中都保持健康即维持结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)状态[3]。当患者免疫功能低下时,可能会进展为活动性结核病。

在抗MTB感染中,许多细胞及细胞因子发挥关键作用。其中包括免疫细胞,如巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδT细胞等[4]。其中,T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞[5],直接参与MTB感染宿主机体的免疫防御。T淋巴细胞先分化为CD4和CD8双阳性T细胞(double positive cell,DP),即CD4+和CD8+T细胞。DP细胞分别经历阳性选择和阴性选择阶段,获取主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性识别能力和对自身抗原的耐受性发育为表面标志为CD4或CD8的单阳性T细胞(single positive cell,SP)[6],成为具有免疫活性的T细胞。笔者对CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗MTB感染免疫应答中发挥作用的机制进行分析,旨在探索抗MTB感染的免疫清除作用,为结核病的诊断和治疗提供借鉴。

CD4+T细胞在MTB感染免疫应答中的作用

MTB通过呼吸道进入机体后首先被巨噬细胞吞噬,从而刺激T细胞增殖和活化,其中CD4+T细胞是参与细胞免疫应答的主要细胞[7],有研究也证实了其在抗MTB感染免疫应答中所起的核心作用[8]。CD4+T细胞可分为辅助性T细胞(Th)1、Th2、Th17及调节性T细胞(regulatory cells,Treg)等细胞亚群[9]。各类CD4+T细胞通过分泌γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等细胞因子来调节巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞等的细胞活性,从而参与MTB的清除[10]。目前,针对CD4+T细胞的研究更多关注其在机体免疫应答中的作用。Künzli和Masopust[11]研究发现,通过酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)对血液样本中CD4+T细胞产生的IFN-γ进行检测,使用“天花疫苗”衍生的重叠肽进行评估。结果显示,在接种疫苗75年后记忆性CD4+T细胞仍可以被检测到。由此可见,记忆性CD4+T细胞在抗MTB感染中的作用至关重要。

一、CD4+T细胞在MTB感染促炎机制中的作用

Th细胞表面均表达CD4分子,当机体感染MTB时,将诱导未接受抗原刺激的初始CD4+T细胞(Th0)分化为Th1[12]。Th1通过分泌各种细胞因子来增强细胞介导的抗感染免疫,活化巨噬细胞及吞噬存在于巨噬细胞囊泡中的MTB。IFN-γ和TNF-α与肺泡巨噬细胞上的受体结合后,通过信号转导促进相关基因的表达,增强抗原呈递能力,促进对MTB的杀伤作用。此外,IFN-γ、白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)还可以增强NK细胞的杀伤能力发挥抗MTB的作用[13]。因此,细胞因子IFN-γ在抗MTB感染免疫中发挥着至关重要的作用。

有研究表明,机体抗MTB感染并非仅依赖IFN-γ[14]。当机体感染MTB或出现细胞因子转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)和IL-6时,将诱导Th0分化为Th17。Th17分泌的细胞因子IL-17和IL-22有强促炎、杀伤MTB的作用[15]。有研究表明,IL-17作为一种炎性细胞因子,在抵抗MTB菌株毒力中发挥重要作用[15]。研究人员使用不同的MTB菌株感染小鼠,其中包括实验室标准株H37Rv和高毒力菌株HN878,再进一步通过比较IL-17缺陷小鼠和野生型小鼠的感染结果,从而发现IL-17对于机体抗高毒力菌株HN878感染早期保护性免疫起重要作用。可见,Th17在抗MTB感染的过程中发挥重要作用。

此外,近期Van Dis等[16]利用从感染小鼠肺部分离的CD4+T细胞来研究抗MTB感染的机制。研究发现,即使在缺乏IFN-γ的情况下,CD4+T细胞也能驱动巨噬细胞活化并控制感染。但是,这种不依赖IFN-γ的免疫应答被低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的激活所控制。进一步探明了CD4+T细胞的抑炎机制网络。

综上所述,MTB特异性Th1主要通过分泌IFN-γ来促进巨噬细胞产生炎症反应,并激活巨噬细胞抗MTB,进一步通过肉芽肿的形成从而加强MTB的清除及遏制结核病的发展[17]。此外,近年来也有来自非人灵长类动物的研究证据表明,Th1和Th17细胞不仅与MTB感染的促炎机制有关,可能还与抑炎机制相关[18]。

二、CD4+T细胞在MTB感染抑炎机制中的作用

1.Treg在MTB感染中的抑炎作用:CD4+CD25+Foxp3+T细胞又被称为免疫调节性T细胞[19]。Treg主要通过两种方式参与MTB感染抑炎机制:(1)直接接触抑制效应细胞的活化;(2)分泌TGF-β、IL-10等细胞因子抑制机体免疫应答[20]。机体感染MTB后将激活Treg,抑制炎症、限制组织损伤[21]。Treg与效应T细胞之间的平衡对疾病的进展非常重要,过强的免疫应答会导致严重的炎症反应或组织损伤,而过强的Treg应答则会下调效应细胞免疫应答水平,导致MTB免疫逃逸并大量增殖[22]。

人体感染MTB后,患者外周血和病灶中的CD4+CD25+T细胞数量明显增加,同时Foxp3、IL-10 和TGF-β1表达增高,后两者的高度表达可以间接抑制IFN-γ介导的杀伤作用[23]。另外,Treg细胞还可以通过程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1,PD-1)途径抑制IFN-γ的产生,IFN-γ的减少将影响到巨噬细胞的激活,减弱机体清除MTB的能力[17]。

综上,Treg细胞在抗MTB感染过程中发挥重要作用。进一步的研究应当注重于抑炎机制中Treg与促炎机制中尤其是与Th17之间的平衡关系。Treg和Th17分别通过分泌IL-10和IL-17介导机体免疫抑制和炎症反应。已有研究发现,Treg/IL-17比值失衡会造成机体的免疫功能异常,炎症反应减弱或持续,进而导致肺结核的发生发展[24]。此外,李威等[25]研究发现,MTB感染机体后,分泌IL-17的同时体内Treg比例将降低。研究进一步发现LTBI者Treg/IL-17比值降低,而活动性结核病患者Treg/IL-17比值明显升高。通过受试者工作特征(ROC)曲线分析,外周血Treg/IL-17比值预测活动性结核病患者的曲线下面积为0.925,最佳截断值为1.821时,敏感度为97%,特异度为90%,提示Treg/IL-17比值对活动性结核病具有较高的预测价值。因此,调节抑炎和促炎两种免疫反应之间的平衡,有助于推动Treg细胞在MTB感染免疫机制中的研究,这也将有望为结核病提供新的免疫治疗思路[17]。

2.共抑制分子在MTB感染中的抑炎作用:有研究表明,某些细胞因子如IL-10、TGF-β以及共抑制分子参与到抗MTB感染免疫应答中,不仅Treg在MTB感染抑炎机制中发挥作用,共抑制分子等在机体MTB感染抑炎机制中同样至关重要[26-27]。

MTB感染后,肺泡巨噬细胞与T细胞在共信号分子配体和受体的相互作用下,介导共刺激或共抑制信号[28]。一方面,由共刺激分子介导的共刺激信号能够保证T细胞的充分与有效活化。另一方面,细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4)、PD-1等共抑制分子介导的共抑制信号能够抑制T细胞的过度活化与增殖[29],从而在维持适度免疫应答中发挥重要的调控作用。其中,共抑制分子PD-1在活化的CD4+T细胞上高度表达,其在MTB感染抑炎机制中发挥尤为重要的作用[30]。

Tezera等[31]通过小鼠实验研究PD-1在MTB感染中的作用,研究发现与野生型对照小鼠相比,PD-1缺陷的实验小鼠的存活率明显降低,肺内MTB的增殖明显增强。研究人员还进一步通过气溶胶感染PD-1缺陷小鼠,结果同样表明PD-1缺陷小鼠肺部炎症反应明显增强,肺内菌落形成单位(colony forming units,CFU)增加及小鼠存活率明显降低。因此,PD-1途径是控制肺部MTB感染所必需的。

Ogishi等[32]对1例死于遗传性PD-1缺陷的结核病患者进行研究,结果发现,在MTB刺激下该患者的淋巴细胞仅产生少量IFN-γ,流式细胞术结果显示,PD-1缺陷患者中γδT细胞表面表达TCRγδ的Vδ2T亚型T细胞(Vδ2γδT)、黏膜相关恒定T细胞和NK细胞等淋巴细胞亚群的IFN-γ产生都存在缺陷。此外,与健康对照组的细胞相比,患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)诱导活化的原始细胞经抗CD3/CD28抗体耦合珠刺激后产生的IFN-γ更少。因此,IFN-γ产生受损可能是PD-1缺乏患者容易感染MTB的原因。

此外,Liu等[33]认为与简单产生大量短寿命效应T细胞的疫苗相比,具有PD-1抗原特异性CD4+T细胞的疫苗能够诱导特异性CD4+T细胞成为具有自我更新潜力的细胞,这可能将增强疫苗的长期保护作用。由此可见,PD-1在控制MTB感染中具有不可或缺的作用,为PD-1缺陷结核病患者的诊断和治疗提供潜在可操作的分子靶点。

CD8+T细胞在MTB感染免疫应答中的作用

尽管各类研究已证实CD4+T细胞在抗MTB感染中发挥了核心作用[34],但大量的小鼠结核病模型的研究结果表明,CD8+T细胞对于机体抗MTB感染也具有保护作用[7]。Cai等[35]研究发现,CD4+和CD8+T细胞对机体抗MTB感染具有不同的效应功能。CD8+T细胞能够识别短肽、非肽类抗原,具有杀伤胞内病原体的能力[34]。MTB特异性CD8+T细胞能够对被MTB感染的靶细胞产生溶细胞效应[36],其能够通过分泌促炎细胞因子,凋亡相关因子配体(factor-related apoptosis ligand,FasL)和Fas受体之间的相互作用及通过分泌穿孔素、颗粒酶、颗粒溶解素从而诱导MTB的凋亡[9]。

记忆性CD8+T细胞是机体清除胞内MTB的重要组分,其特点是能够长期存活,并能够在MTB再刺激后快速大量增殖[37]。记忆性CD8+T细胞可以在表型、定位和功能上发生变化,从而快速保护宿主。CD8+T细胞具有提供广泛反应性保护的潜力,可以抵抗表面蛋白迅速突变的病毒,在机体抗MTB感染中发挥重要作用[38]。

一、CD8+T细胞释放细胞因子及通过凋亡相关因子受体-配体(Fas-FasL)相互作用参与MTB感染免疫应答

当机体感染MTB后,肺泡巨噬细胞可将MTB的降解肽段和脂蛋白抗原提呈给CD8+T淋巴细胞,CD8+T细胞被激活后释放IFN-γ、TNF-α、IL-2等,进而激活巨噬细胞杀伤细胞内的MTB[39]。其中,IFN-γ的主要效应是活化MTB感染的巨噬细胞,但也有研究发现,并非所有的MTB特异性CD8+T细胞都能产生IFN-γ,其细胞功能之间可能存在不一致性[40]。另外,也有研究证实,当使用四聚体技术计数单一肽段抗原特异性的CD8+T细胞时,这种细胞之间的不一致性尤为明显[41]。

此外,CD8+T细胞可通过Fas-FasL共刺激分子相互作用参与MTB感染的免疫应答。MTB特异性CD8+T细胞上的FasL与靶细胞上的Fas相互作用,使MTB从肺泡巨噬细胞中释放出来,然后再被邻近激活的肺泡巨噬细胞吞噬杀灭[42],从而杀灭MTB,诱导凋亡。

二、CD8+T细胞通过穿孔素、颗粒酶、颗粒溶解素参与MTB感染免疫应答

CD8+T细胞的杀伤机制通常依赖于穿孔素的产生,有研究发现,当机体感染MTB后,CD8+T细胞穿孔素和颗粒酶的表达将上调[43]。一方面,穿孔素能够作为将其他蛋白质输送到靶细胞的通道。另一方面,穿孔素还能够溶解已发生MTB感染的巨噬细胞。同时,CD8+T细胞能够表达颗粒酶,当CD8+T细胞与靶细胞结合时,这些颗粒酶将通过穿孔素运送至靶细胞。此外,Lin和Flynn[44]认为由于实验小鼠中缺乏穿孔素,所以想要进一步探索CD8+T细胞功能与穿孔素的关系将具有一定的挑战性。

有研究发现,与小鼠不同的是,人类和猕猴的肉芽肿中的CD8+T细胞能够表达另一种重要的细胞溶解蛋白即颗粒溶素[44]。颗粒溶素能够破坏细胞壁并扰乱MTB中的脂质代谢,但目前研究对于颗粒溶素在细胞介导的抗MTB感染免疫中的作用尚未完全了解[45]。总的来说,颗粒酶、颗粒溶解素利用穿孔素在靶细胞中形成的通道使蛋白酶进入巨噬细胞内,从而导致MTB感染的巨噬细胞被溶解,这主要是通过颗粒胞吐作用途径使已感染MTB的巨噬细胞凋亡[42]。

三、NK样CD8+γδT细胞在MTB感染免疫应答中的作用

MTB感染后,外周血中的γδT细胞比例大幅度升高,γδT细胞被激活后释放大量的IFN-γ、IL-2、穿孔素和色氨酸酯酶,从而激活巨噬细胞并溶解MTB感染的细胞[42]。近期,Lin和Flynn[44]对一群来自南非的青少年的外周血中的γδT细胞进行了分析,发现一个独特的γδT细胞亚群,即CD8+γδT细胞。

CD8+γδT细胞表面有两个经典髓系细胞标志物CD11c和CD70,这两个标志物在αβT细胞上的表达与抗原驱动反应和慢性免疫激活有关[46]。在CD8+γδT细胞中,CD11c的表达和功能可能与其在黏膜和表皮这样的组织中的定位和迁移有关。CD11c同时也参与调节γδT细胞与其他细胞(如抗原呈递细胞)的相互作用,影响抗原识别和免疫反应的效率[47]。另外,CD70在CD8+γδT细胞上的作用可能与在CD8+αβT细胞上类似,即通过与CD27的相互作用促进细胞的活化、增殖和功能[48]。然而,CD11c和CD70更具体的作用机制及区别尚不清楚,仍需要更进一步的探索。有研究发现,MTB感染中的CD8+γδ T细胞反应类似于在巨细胞病毒和其他一些病毒感染中的“记忆膨胀”现象,即CD8+γδT细胞具有强大的效应功能和克隆扩张的能力,其甚至在T细胞反应发生后仍然持续[44]。

CD8+γδT细胞与NK细胞一样,可以产生CD16介导的细胞毒性反应。研究人员将其称为NK样CD8+γδT细胞,这类细胞在MTB感染中能够通过不同途径产生细胞因子参与免疫应答。NK样CD8+γδT细胞的增加伴随着CD8-γδT细胞频率的降低。与CD8-γδT细胞相比,CD8+γδT细胞表达CD16、颗粒酶和穿孔素的水平明显升高,通过CD16介导的细胞毒性功能也明显增强[49]。

CD4+T细胞对CD8+T细胞的促进作用

Lu 等[38]研究发现,CD8+T细胞能够独立参与机体免疫应答,在缺乏CD4+T细胞的情况下,由CD8+T细胞参与的抗MTB感染免疫应答并没有明显延迟。此外,研究人员对MTB感染8周后的实验小鼠进行RNA测序。结果表明,在MTB感染期间,CD4+T细胞促进CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α,且增强了CD8+T细胞毒性。同时,CD4+T细胞能够促进CD8+T细胞产生IL-2,IL-2和IL-21又能够保证CD8+T细胞的存活。

此外,Sun和Bevan[50]研究发现,CD4+T细胞对CD8+T细胞的分化有促进作用,其主要机制是通过树突状细胞(dendritic cells, DC)的“许可”作用。首先,通过DC和CD4+T细胞之间的CD40∶CD40L相互作用介导,从而允许DC的功能成熟。由此,CD4+T细胞能够增加DC的抗原呈递和共刺激能力,即“许可”作用。获得“许可”的DC即可以与CD8+T细胞相互作用并诱导强烈的原发性反应。另外,在某些情况下,CD40∶CD40L相互作用也可以直接发生在CD8+T细胞和CD4+T细胞之间。由此,CD4+T细胞在CD8+T细胞的分化中至关重要。

综上,CD4+T细胞对CD8+T细胞具有促进作用。但是,研究进一步发现很难将CD4+T细胞的辅助作用与其对CD8+T细胞的效应作用分开[38],所以,CD4+T细胞是否有助于CD8+T细胞介导更大的免疫应答目前尚无定论,而CD8+T细胞对CD4+T细胞是否有平衡作用也仍需进一步研究。

总结和展望

近年来,国内外学者在抗MTB感染免疫应答机制上展开了多角度、多维度的探讨和研究,基本确定了CD4+T细胞及CD8+T细胞分别通过不同效应网络在MTB感染免疫应答中发挥着重要作用。一方面,CD4+T细胞对于机体抗MTB免疫应答与抑制机体免疫应答之间的平衡至关重要。其中,Th1、Th17在抗MTB感染中发挥促炎作用,Treg和共抑制分子等在抗MTB感染中发挥抑炎作用。另一方面,CD8+T细胞在抗MTB感染中的作用也不容忽视,其中NK样CD8+γδT细胞发挥至关重要的作用,其作用机制有待进一步研究。

有关各类细胞在结核病免疫应答中作用及功能的研究不应是孤立的,应综合代谢组学、基因组学、蛋白质组学、表观遗传学等不同学科、多种技术手段加以综合分析,以获得更全面、客观的信息。在未来的研究中更应深入理解MTB诱导的免疫功能具体特征及机制,对于结核病的早期诊断、有效免疫干预、预后判断及新型抗结核疫苗的设计都至关重要。当然,目前对于CD4+和CD8+T细胞在结核病免疫应答机制的研究存在一定局限性,未来应进一步对机体抗MTB感染的T淋巴细胞免疫应答机制展开深入研究,将对结核病的诊断和治疗具有极其重要的意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献温淑芳:起草文章、文稿修改;魏荣荣:文献查询和汇总;李浩然:对文章的知识性内容作批评性审阅;刘毅:文章设计、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政/技术/材料支持、指导、支持性贡献