雅鲁藏布江中游拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测及生物量评估

李冰 冯秀 朱仁 隋晓云 贾银涛 陈毅峰

摘要：建立快速和准确的环境DNA（eDNA）检测方法，可为鱼类的长期监测提供便利，为鱼类资源保护和管理提供技术支撑。2019年在雅鲁藏布江中游干流及拉鲁湿地和茶巴朗湿地采集了20种鱼和水样，针对拉萨裸裂尻鱼（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）设计Cytb基因的特异性引物和探针，利用微滴式数字PCR（ddPCR）检测水样中eDNA拷贝数，并分析其与生物量和丰度之间的相关性。结果显示，正反向引物及探针序列与其他19种鱼之间的平均错配碱基数分别为6.8、6.9和3.6，且对其基因组DNA进行ddPCR扩增没有荧光信号。通过对比ddPCR和网捕2种方法，70%样点中检测结果相同，剩余30%样点都是网捕未捕获但ddPCR检出的情况。在拉鲁湿地和雅鲁藏布江干流的样点中，水样eDNA拷贝数与拉萨裸裂尻鱼生物量和丰度之间均具有显著的相关性，拉鲁湿地水样eDNA与二者的相关系数分别为0.987和0.647，雅鲁藏布江水样eDNA与二者的相关系数分别为0.786和0.756，表明eDNA技术是鱼类分布和生物量监测的有效方法。eDNA检测易受到近缘物种和水体理化性质的影响。

关键词：环境DNA；微滴式数字PCR；拉萨裸裂尻鱼；物种检测；雅鲁藏布江中游

中图分类号：Q503        文献标志码：A        文章编号：1674-3075（2024）02-0084-08

环境DNA（eDNA）指从空气、水、土壤、排泄物、沉积物等环境样品中提取的DNA（Bohmann et al，2014）。环境DNA技术通过对eDNA进行定性和定量分析，进而获得eDNA中的生物多样性信息，已逐渐发展成为鱼类多样性监测的新方法（徐念和常剑波，2016；吴昀晟等，2019；王梦等，2022）。与传统方法相比，环境DNA技术具有灵敏度高、省时省力、环境友好、对调查对象无损伤、不依赖于分类学专家等优点（邢迎春等，2022）。鱼类的eDNA监测主要有2个方面，即通过高通量测序和eDNA宏条形码（eDNA metabarcoding）对多物种进行检测，及通过定量PCR对特定物种进行检测（高天翔等，2018）。高通量測序和eDNA宏条形码虽然能同时检测多物种，但由于扩增引物及测序过程的偏差，对单一物种丰度的评估不理想（Balasingham et al，2018）；而定量PCR使用物种特异引物，可对单一目标物种的存在和生物量进行检测（Doi et al，2015）。

常用的定量PCR包括实时荧光定量PCR（qPCR）和微滴式数字PCR（ddPCR）等，在鱼类eDNA研究中均有应用（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；Brys et al，2021；Wang et al，2021）。qPCR技术虽具有快速、简单、经济等特点，可用于分析eDNA中目标物种的相对丰度，但需要制作标准曲线，且在目的序列含量低或含有大量其他序列的情况下灵敏度和精确度会受限制（王芮等，2021）；而ddPCR可在没有参考曲线的情况下提供目标物种DNA的绝对定量，在鱼类生物量调查中更具有优势（Doi et al，2015）。ddPCR是一种定量分析核酸的技术，通过把反应体系分散到10 000～20 000个微滴中，再由PCR扩增和阳性信号读取，计算得出样本中DNA最初拷贝数，从而实现对DNA的绝对定量（Hindson et al，2011）。研究表明，与qPCR相比，ddPCR的误差更小，且更适用于低浓度下的eDNA检测（Rusch et al，2018）。

拉萨裸裂尻鱼（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）裂腹鱼亚科（Schizothoracinae）裸裂尻鱼属（Schizopygopsis）（陈毅峰和曹文宣，2000），自然分布于雅鲁藏布江中上游干支流水体中，是我国特有的高原性鱼类，也是西藏地区主要经济鱼类之一，对研究生物地理学、系统演化和营养生理等方面具有极为重要的科学参考价值（He & Chen，2007；Liang et al，2017; 曾本和等，2019）。随着近几十年来西藏经济的快速发展，水利设施建设、外来物种入侵及环境污染等导致拉萨裸裂尻鱼资源出现急剧下降的趋势（杨汉运等，2010；朱挺兵等，2017），拉萨裸裂尻鱼已被列入中国脊椎动物红色名录（蒋志刚等，2016）。此外，拉萨裸裂尻鱼由于生长缓慢、性成熟晚、繁殖力低等特点，其资源一旦遭到破坏，将很难得到恢复（邵俭等，2019）。因此，建立快速、便捷、准确的eDNA检测方法，对拉萨裸裂尻鱼资源状况进行长期监测，可为其资源保护和管理提供科学依据。本研究在雅鲁藏布江中游干流及拉鲁湿地和茶巴朗湿地采集鱼类和水样，针对拉萨裸裂尻鱼，设计物种特异的Cytb引物和探针，评估其扩增效果，利用ddPCR检测水样中eDNA拷贝数，并分析其与物种生物量与丰度之间的相关性。

1   材料与方法

1.1   样品采集

2019年在雅鲁藏布江中游干流（YJ1～YJ8）、拉鲁湿地（LL1～LL10）和茶巴朗湿地（CBL1～CBL5）设置23个样点（图1）开展样本采集工作。使用地笼（开口40 cm×30 cm，长8 m）经10～12 h起捕采集2个湿地的鱼类样本；对于雅鲁藏布江的样点，除了使用地笼之外，还使用三层流刺网（网目2～8 cm，高1.5 m，长20 m）作业0.5 h采集鱼类样本。统计拉萨裸裂尻鱼的个体数量和体重，剪取部分个体的一小块鳍条组织保存在无水乙醇中。用采水器采取上、中、下层混合水样共1 L，在4 h内用真空抽滤泵和混合纤维滤膜（直径47 mm，孔径0.45 μm）对水样进行抽滤。每个样点采集3个平行水样，并设置1个阴性对照。滤膜立即放入2 mL无酶无菌离心管，并置于液氮中保存，直至放入实验室的超低温（-80℃）冰箱。每次采集水样和抽滤之后，利用10%的商用漂白液对采集和抽滤工具进行消毒，并用纯净水冲洗干净。

1.2   eDNA提取

每次实验前用DNA-off试剂（Takara公司）对实验用具和实验桌面进行浸泡和擦拭，3 min后用清水冲洗或湿纸巾擦拭干净。用DNeasy Blood & Tissue Kits试剂盒（Qiagen公司）提取水样DNA，实验步骤按说明书进行。水样DNA最终用200 μL TE溶液稀释，并于-20℃条件下保存。

1.3   引物和探针设计

在鱼类eDNA研究经常使用的线粒体分子标记中，选择进化速度较快的Cytb基因序列（Zardoya & Meyer，1996）作为分子标记，采用通用引物（F： GRCTTGAARAACCACCGTTGT; R： CGGWTTACAAGACCGRYGCT）（Feng et al，2023）经DNA测序获得渔具捕捞得到的20种鱼Cytb基因序列。为了扩大引物和探针的应用范围，将分布于雅鲁藏布江流域上游或湖泊的尖裸鲤（Oxygymnocypris stewartii）、高原裸鲤（Gymnocypris waddelli）、兰格湖裸鲤（Gymnocypris chui）和软刺裸鯉（Gymnocypris dobula）（陈毅峰和曹文宣，2000；朱挺兵等，2017；刘明典等，2020）等4种鱼对eDNA检测的影响也考虑在内，从NCBI数据库中提取它们的Cytb基因序列。利用MEGA软件的ClustalW功能（Thompson et al，1994；Tamura et al，2013）对上述24种鱼的Cytb基因序列进行线性排列，利用Primer5软件根据以下原则设计检测拉萨裸裂尻鱼的引物和探针：（1）正反向引物序列与其他23种鱼相比至少具有2个碱基的差异；（2）正反向引物及探针序列在种内保守，没有变异；（3）扩增长度为100～200 bp；（4）其他参照常规引物和探针的设计规则（Rozen & Skaletsky，2000）。

1.4   引物扩增效果评估

将拉萨裸裂尻鱼的基因组DNA稀释至1 ng/μL作为模板进行ddPCR，设置53～59℃的退火温度梯度，用于筛选最佳扩增温度。反应体系包含2 μL DNA 模板，250 nmol/L上下游引物和150 nmol/L探针，10 μL 2× ddPCR Supermix for Probes（不含 dUTP），并用超纯水将反应体系补至20 μL。用微滴生成卡将20 μL反应体系与70 μL微滴生成油（Droplet Generator Oil for Probes）在微滴生成仪中生成微滴。PCR扩增反应在密封的96孔板内进行，反应条件为：95℃预变性10 min；94℃变性30 s，退火1 min，40个循环；98℃保持10 min；4℃保持至拿出。扩增结束后放入微滴读取仪中，用QuantaSoft软件读取结果。

将拉萨裸裂尻鱼基因组DNA进行梯度稀释，稀释至10、1、0.1、0.01和0.001 ng/μL作为模板进行ddPCR实验，检测ddPCR的扩增效率及可检出的浓度范围。将捕捞得到的20种鱼以及从羊卓雍措采集的高原裸鲤基因组DNA分别稀释到1 ng/μL作为模板进行ddPCR，检测ddPCR扩增的物种特异性。

1.5   eDNA的ddPCR扩增及数据处理

对每个eDNA样品进行ddPCR扩增，每个样品设置3个重复。反应体系和反应条件同上。用QuantaSoft 软件读取检测结果，即ddPCR反应体系中目标DNA拷贝数（copies/μL），根据水样体积和eDNA的稀释体积计算每个水样中拉萨裸裂尻鱼Cytb基因片段的拷贝数，计算公式为：

式中：x为ddPCR反应体系中目标DNA拷贝数（copies/μL），y为水样中目标DNA拷贝数（copies/mL）。利用SPSS软件分析水样中eDNA拷贝数与物种生物量和丰度之间的相关性。

2   结果与分析

2.1   引物和探针

根据种间特异性高、种内保守、扩增子长度适合的原则，在Cytb基因的编码区914～935 bp和1 067～1 090 bp分别设计了正反向引物（SyCytb-F/R），在编码区942～964 bp设计了探针（SyCytb-P）。引物和探针序列为：SyCytb-F，5-CTCTGCTCCATACCTCCAAGCT-3；SyCytb-R， 5-TGAGAAACAGTGCAAAGTACAGGG-3；SyCytb-P，5-FAM-ACTAACATTCCGCCCAATCACCC-MGB-3。正向引物、反向引物和探针序列与拉萨裸裂尻鱼之间没有错配碱基，与尖裸鲤及3种裸鲤（高原裸鲤、兰格湖裸鲤和软刺裸鲤）之间的平均错配碱基数分别为2.2、1.3和1.0个，与其他19种鱼之间的平均错配碱基数分别为6.8、6.9和3.6个（图2）。

2.2   扩增效果

温度梯度实验结果显示，在退火温度的梯度范围内，ddPCR都检测到有效DNA拷贝数，其中，在56℃时拷贝数达到峰值，因此，将56℃作为ddPCR的最佳退火温度。浓度梯度实验结果显示，在拉萨裸裂尻鱼基因组DNA浓度为0.001～1 ng/μL时均可获得有效DNA拷贝数，当模板DNA浓度为10 ng/μL时，阳性微滴数远大于阴性微滴数，检测结果显示无信号（图3-a）。DNA拷贝数与DNA浓度之间拟合标准曲线的R2为0.998。物种特异性检测结果显示，引物和探针具有物种特异性，仅在拉萨裸裂尻鱼和高原裸鲤中获得荧光信号，在其他19种鱼中均未检出（图3-b）。因此，当水体中存在尖裸鲤或3种裸鲤时，都可能影响拉萨裸裂尻鱼的eDNA检测结果，说明本研究的探针和引物不适用于雅鲁藏布江流域的湖泊或上游等有其他近缘种（裸鲤属和裸裂尻鱼属）分布的水体。

2.3   eDNA的ddPCR检测

在阴性对照中，均未检测出荧光信号。共在14个样点中检测出拉萨裸裂尻鱼的eDNA，其中，在茶巴朗湿地、拉鲁湿地和雅鲁藏布江干流中检测出的样点数分别为4、4和6个（表1）。在茶巴朗湿地、拉鲁湿地和雅鲁藏布江干流样点中检测出拉萨裸裂尻鱼eDNA的拷贝数分别为2.4～6.3、1.9～319.3和1.6～2.3 copies/mL。

2.4   eDNA检测与捕捞结果的比较

将ddPCR检测与捕捞结果进行比较，结果显示，70%样点ddPCR检测结果与捕捞结果相同，30%样点中未捕获但ddPCR检出，没有样点捕获到但ddPCR未检出的情况（图4）。其中，在拉鲁湿地各样点中的检测结果均相同；在大部分茶巴朗湿地样点（4/5）及部分雅鲁藏布江样点（3/8）中未捕获但ddPCR检出。

总体上，eDNA拷贝数（copies/mL）与物种生物量（g）和丰度（尾）之间均无显著相关性（表2）。但是，单独对拉鲁湿地和雅鲁藏布江的样点进行分析，eDNA拷贝数与物种生物量和丰度之间均存在显著相关性。

在拉鲁湿地样点中，eDNA拷贝数与物种生物量和丰度之间的相关系数分别为0.987（P<0.01）和0.647（P<0.05），拟合线性方程分别为：

式中：y1、y2和x分别为物种生物量和丰度及eDNA拷贝数。

在雅鲁藏布江的样点中，eDNA拷贝数与物种生物量和丰度之间的相关系数分别为0.786和0.756（P<0.05），拟合线性方程分别为：

拉鲁湿地样点的单位质量的eDNA拷贝数[copies/（mL·g）]和单位个体的eDNA拷贝数[copies/（mL·个）]显著大于雅鲁藏布江的样点。

3   讨论

对于单一目标物种的eDNA检测，需要种间特异性高、种内通用性强的扩增引物，否则极易出现假阳性或者假阴性的错误结果（高天翔等，2018）。本研究中，拉萨裸裂尻鱼的ddPCR引物序列与其他物种之间具有较多的错配碱基数量，且在其他物种中的扩增没有荧光信号，但尖裸鲤及3种裸鲤除外，它们的存在会影响拉萨裸裂尻鱼的eDNA检测。我们对拉萨裸裂尻鱼与其他23种鱼的线粒体基因组DNA序列进行了比较，发现拉萨裸裂尻鱼与尖裸鲤、高原裸鲤、兰格湖裸鲤和软刺裸鲤分别仅有1 240、1 241、1 239和91个差异碱基，而与其他19种鱼的差异碱基数为1 551～4 640个（图5）。基于线粒体DNA及基因组SNP标记的分析表明，裸鲤属（Gymnocypris）和裸裂尻鱼属（Schizopygopsis）的物种在系统进化关系上不以属名而以水域形成聚类分支（Tang et al，2019）；DNA条形码的研究结果也表明，裸鲤属和裸裂尻鱼属的部分物种共享操作分类单元（OTUs）（Shen et al，2019）。因此，裸鲤属或裸裂尻鱼属内单一物种的eDNA检测不可避免地受到裸鲤属和裸裂尻鱼属其他鱼类的影响。但是，对于本研究的样点区域，拉萨裸裂尻鱼的eDNA检测结果不受尖裸鲤或其他裸鲤的影响。首先，在所有样点区域未采集到这些鱼类样本；其次，近期的调查研究表明，尖裸鲤仅在雅鲁藏布江仁布以上江段出现（朱挺兵等，2017；刘明典等，2020），且高原裸鲤、兰格湖裸鲤和软刺裸鲤主要分布于湖泊水体中。总之，在使用本研究的ddPCR引物对自然水體的拉萨裸裂尻鱼进行分子检测时，需要考虑尖裸鲤属、裸鲤属或裸裂尻鱼属其他鱼类的影响。

大量研究表明，与网捕相比，eDNA技术在物种检测方面具有明显的优势（Czeglédi et al，2021）。在本研究中，与网捕相比，基于eDNA的物种检测同样有优势，2种方法在70%样点中的检测结果相同；在剩余30%样点中，均是网捕未捕获但eDNA检出的情况，主要体现在茶巴朗湿地和雅鲁藏布江的样点。茶巴朗湿地位于拉萨河附近，虽然水源来源于拉萨河（连接拉萨河的水渠长4 km），但是采样时未见水渠中有水，在茶巴朗湿地检测的拉萨裸裂尻鱼eDNA来源于拉萨河的可能性较小。茶巴朗湿地是西藏主要土著鱼类（包括拉萨裸裂尻鱼）的养殖繁育基地，而水样采于非养殖用途的浅水池塘。在茶巴朗湿地样点中未捕获拉萨裸裂尻鱼但水样中检出其eDNA，说明有2种可能：（1）样点水体中确实有拉萨裸裂尻鱼个体，但由于个体小等原因未能捕获；（2）样点水体中没有拉萨裸裂尻鱼个体，目标eDNA来源于临近养殖池塘的个体。拉萨裸裂尻鱼在雅鲁藏布江中游干流中分布广泛（朱挺兵等，2017），通过eDNA几乎在所有样点中检测出其存在，但通过网捕仅在部分样点采集到其个体，说明eDNA具有更高的检出率。

大量研究表明，在实验室条件下，物种的eDNA拷贝数与生物量或丰度之间具有显著的相关性（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；闫卉果等，2022），但在自然水体中的研究较少。本研究中，总体上，水样中eDNA拷贝数与拉萨裸裂尻鱼生物量和丰度之间均无显著相关性；但是，单独对拉鲁湿地和雅鲁藏布江的样点进行分析，均存在显著的相关性。研究表明，eDNA检测易受水体理化性质影响，如温度、pH、溶解氧、矿化度、水流速度和微生物等（Jane et al，2015；Eichmiller et al，2016；Jo et al，2019）。拉鲁湿地和雅鲁藏布江样点的水体在水流速度、温度[（13.11±1.40）℃ vs（11.48±1.56）℃， P<0.05]、溶解氧[（6.87± 0.8）mg/L vs （7.72±0.29）mg/L， P<0.05]和pH[（9.00±0.53）vs（7.75±0.11）， P<0.01]等方面具有明显的差异，导致不同水体中拉萨裸裂尻鱼eDNA的脱落和降解速度及停留时间都可能存在显著差异，因此，不能通过eDNA来比较这2个水体中拉萨裸裂尻鱼的生物量和丰度。与雅鲁藏布江中游干流相比，拉鲁湿地的水体流速较缓且各样点水体理化性质差异较小，这可能是拉鲁湿地样点eDNA拷贝数与生物量之间的相关系数更大，且单位质量eDNA拷贝数更大的主要原因。

4   結论

本研究设计了检测拉萨裸裂尻鱼的eDNA特异性高、时效性好、扩增效率高的引物和探针，并利用ddPCR对雅鲁藏布江中游干流及拉鲁湿地和茶巴朗湿地的水体进行了拉萨裸裂尻鱼的检测。与网捕相比，eDNA技术在物种检测方面具有更高的检出率。在拉鲁湿地和雅鲁藏布江的样点中，水样中eDNA拷贝数与拉萨裸裂尻鱼生物量和丰度之间均具有显著的相关性。表明eDNA技术是鱼类分布和生物量监测的有效方法。但是，eDNA检测结果易受到近缘物种和水体理化性质的影响，是其不足之处。

志谢：感谢中国科学院水生生物研究所分析测试中心的乔志仙、柴小翠及周园园在实验中提供的帮助，感谢熊雄副研究员提供环境数据。

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（責任编辑   熊美华）

收稿日期：2022-01-12      修回日期：2023-08-29

基金项目：第二次青藏高原综合科学考察研究项目（2019QZKK0304，2019QZKK0501），中国科学院战略性先导科技专项（XDA2005020403）。

作者简介：李冰，1996年生，女，硕士研究生，主要从事鱼类环境DNA研究。E-mail： 15007195038@163.com

冯秀，1989年生，男，副研究员，主要从事鱼类分子生态学研究。E-mail： fengxiu@ihb.ac.cn

通信作者：陈毅峰，男，研究员。E-mail： chenyf@ihb.ac.cn