云南盐津乌骨鸡肉中鲜味肽的提取与鉴定

杨超辉 梁双敏 葛长荣 肖智超

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.003

引文格式：杨超辉，梁双敏，葛长荣，等.云南盐津乌骨鸡肉中鲜味肽的提取与鉴定[J].中国调味品，2024，49（5）：10-15，46.

YANG C H， LIANG S M， GE C R， et al.Extraction and identification of umami peptides from Yunnan Yanjin black-bone chicken[J].China Condiment，2024，49（5）：10-15，46.

摘要：利用超滤和凝胶过滤色谱法对盐津乌骨鸡肉中的鲜味肽进行分离纯化，结合感官评价得到鲜味最佳的组分F1，进一步采用液相色谱-串联质谱联用技术从F1组分中鉴定出鲜味肽，对鉴定出的鲜味肽进行条件筛选、氨基酸组成和活性片段预测分析。结果表明，从盐津乌骨鸡肉中鉴定出921条多肽，筛选后得到551条多肽，通过鲜味活性预测得到鲜味片段出现频率大于1的10条多肽，其中DTEEVEHGEE、EVHEEEVH、HEAEEVHEE、HEKLSEESEE、KVED、TPIPDLP 6条多肽可能具有较强的鲜味。

关键词：盐津乌骨鸡；鲜味肽；分离鉴定；条件筛选；活性预测

中图分类号：TS201.1      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）05-0010-06

Extraction and Identification of Umami Peptides from Yunnan

Yanjin Black-Bone Chicken

YANG Chao-hui1，2， LIANG Shuang-min1，2， GE Chang-rong3， XIAO Zhi-chao1，2*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，

China; 2.Yunnan Engineering Technology Research Center of Animal Products Processing，

Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 3.Yunnan Agricultural

University， Kunming 650201， China）

Abstract： The umami peptides from Yanjin black-bone chicken are separated and purified by ultrafiltration and gel filtration chromatography， and the component F1 with the best umami is obtained by sensory evaluation. The umami peptides are further identified from F1 component by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， and condition screening， amino acid composition and active fragment prediction analysis are conducted on the identified umami peptides. The results show that 921 polypeptides are identified from Yanjin black-bone chicken， and 551 polypeptides are obtained after screening.Ten polypeptides with frequency greater than 1 are obtained by the prediction of umami activity， among which， DTEEVEHGEE， EVHEEEVH， HEAEEVHEE， HEKLSEESEE， KVED and TPIPDLP may have strong umami.

Key words： Yanjin black-bone chicken; umami peptides; separation and identification; condition screening; activity prediction

收稿日期：2023-10-17

基金項目：国家自然科学基金项目（32260638）

作者简介：杨超辉（1997—），男，硕士研究生，研究方向：畜产品加工。

*通信作者：肖智超（1985—），男，副教授，博士，研究方向：畜产品加工、功能性食品。

鲜味是5种基本口味之一，是食品风味评价体系中的重要因素。研究表明，鲜味化合物不仅能产生令人愉悦的味道，而且能改善整体感官质量[1]。鲜味肽通常包含在肉制品、蛋白质水解产物和微生物制品中，其分子量通常低于3 000 Da[2]。Yamasaki等[3]最早从木瓜蛋白酶处理的牛肉中发现了鲜味八肽，此后在多种食品中均鉴定出鲜味肽，如臭鳜鱼[4]、鸡蛋蛋白[5]、牛肝菌[6]中。

近年来，对优质地方鸡肉的风味研究较多。中国优质地方鸡品种与商业型肉鸡相比，具有风味浓郁、肉质紧实等特点，这主要是由于地方鸡肉中水溶性化合物（氨基酸、核苷酸、有机酸、氨基酸衍生物等）、脂肪酸和挥发性风味物质优于商业型肉鸡[7-8]。除上述物质外，呈味肽也在鸡肉风味形成过程中起到关键作用。何颖等[9]从武定鸡肉中分离鉴定出8条多肽，其中LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL 3条多肽被确定为武定鸡肉中鲜味的关键组分。Liang等[10]通过动态定量描述分析和暂时性感官支配法对感官数据进行分析，对鸡汤的味道进行表征，最后鉴定出9条味觉肽。其中，AGPSIVH、IKDPHVD和TPPKID具有鲜味特征，KDPHVD、FAGDDAPR和NALNDITSL具有增强鲜味的作用。

盐津乌骨鸡是云南优质地方鸡种，主要生长于云南省昭通市盐津县，它集美味、保健、药用于一体，体型、外貌和生长性能相对稳定，属于药用肉蛋兼用型品种[11]。目前有关盐津乌骨鸡的研究主要集中在生长性能[12]和风味物质[13]方面，对盐津乌骨鸡鲜味肽的分离鉴定鲜有报道。本研究采用超滤凝胶过滤色谱对盐津乌骨鸡肉中的鲜味成分进行分离纯化，结合感官分析确定鲜味最强的组分，以液相色谱-串联质谱联用技术鉴定组分中的鲜味肽氨基酸序列和分子量，并对鉴定出的鲜味肽进行筛选。本研究不仅填补了盐津乌骨鸡鲜味肽研究领域的空白，增加了新型鲜味肽的数量，而且对盐津乌骨鸡精深加工的方向、鲜味肽的研究利用及呈鲜机制的分析具有重要意义。

1  材料与方法

1.1  材料

选取同一饲养条件下同一批次的180日龄的盐津乌骨鸡，由云南省盐津县本城农业科技有限公司提供，屠宰后洗净，于－20 ℃保存。

1.2  试剂

葡聚糖凝胶G-15：上海源叶生物科技有限公司；蔗糖、盐、味精（均为食品级）：沃尔玛百货有限公司；柠檬酸（食品级）：山东柠檬生化有限公司；异亮氨酸（食品级）：上海千味食品有限公司。

1.3  主要仪器与设备

S18-LA170碎肉机  九阳股份有限公司；XHF-D高速分散器、Scientz-18真空冷冻干燥机  宁波新芝生物科技股份有限公司；H3-18K离心机  湖南可成仪器设备有限公司；MSC300超滤杯  上海摩速科学器材有限公司；IT-09C10磁力搅拌器  上海一恒科学仪器有限公司；HC-0120-06玻璃层析柱  北京瑞达恒辉科技发展有限公司；BSZ-100自动部分收集器  上海泸西分析仪器厂有限公司；BT102S-1-CE恒流泵  保定雷弗流体科技有限公司；LC-MS/MS仪  美国赛默飞世尔科技公司。

1.4  方法

1.4.1  盐津乌骨鸡肉水提物的制备

参考Zhang等[14]的方法并略作改动。取解冻的盐津乌骨鸡，去皮，去除鸡肉中可见油脂，清洗干净血水。取250 g鸡肉，绞碎后加入800 mL超纯水，以100 000 r/min匀浆3次，每次20 s，静置1 h后离心（4 ℃，8 000 r/min，10 min），取上清液过滤除去漂浮的油脂和无法沉淀的杂质。按上述步骤，离心沉淀物加200 mL超纯水重复提取1次，合并2次滤液储存于4 ℃冰箱中备用。

1.4.2  盐津乌骨鸡肉水提物中鲜味肽的超滤分离

参考Su等[15]的方法并略作改动。盐津乌骨鸡肉水提物通过3 000 Da和1 000 Da的超滤膜于4 ℃下进行分级纯化：首先通过3 000 Da的超滤膜，再通过1 000 Da的超滤膜，得到组分U1、U2和U3，分别对应分子量>3 000 Da、3 000～1 000 Da和<1 000 Da。收集超滤得到的所有组分，冷冻干燥成粉末，用于感官分析，选择鲜味最强的组分用于下一步分离纯化。

1.4.3  超滤组分的凝胶过滤色谱分离

参考别朋宇等[16]的方法并略作改动。将鲜味较强的超滤组分U3经超纯水复溶，混合制成15 mg/mL的水溶液，经0.45 μm水相滤膜過滤后，再通过Sephadex G-15 凝胶层析柱（1.6 cm×70 cm）分离出鲜味更强的组分。以超纯水作为洗脱液进行洗脱，设置流速为1 mL/min，每次上样2 mL后，用自动部分收集器收集，每3 min收集一管，在220 nm波长处测定吸光值。分别将每个分离峰单独收集、合并，冷冻干燥成粉末，用于感官分析，选择鲜味最强的组分。

1.4.4  鲜味肽序列的鉴定

采用LC-MS/MS分析鲜味得分最高的凝胶色谱分离纯化组分的氨基酸序列和分子质量。取3 mL样品，用Empore固相萃取柱C18-SD（7 mm，3 mL）进行脱盐，多肽组分冻干后，用40 μL 0.1%的三氟乙酸水溶液复溶，上机待测。

参考桂海佳等[17]的方法并略作改动。色谱条件：采用Nano-HPLC液相系统Easy-nLC进行分离，自动进样到Zorbax 300SB-C18色谱柱，再经过液相色谱柱分离，流速为250 nL/min。设定0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）为流动相B；用95% A和5% B对液相色谱柱RP-C18（75 μm×150 mm，3 μm）进行平衡；洗脱梯度设置：0～50 min，96%～50% A、4%～50% B；50～54 min，50%～0% A、50%～100% B；54～60 min，0% A、100% B。

质谱条件：样品经高效液相色谱分离后用Q Exactive质谱仪进行质谱分析，分析时间：60 min；检测方式：正离子；母离子扫描范围（m/z）：300～1 800 amu；一级质谱分辨率：70 000（m/z为200时）；AGC目标：1e6；一级最大IT值：10 ms；扫描范围数：1；动态排除：20.0 s；多肽和多肽的碎片的质荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集10个碎片图谱（MS2 scan）。MS2激活类型：HCD；隔离窗口：1.6 m/z；二级质谱分辨率：17 500（m/z为200时）；显微扫描：1；二级最大IT值：60 ms；碰撞能量归一化：27 eV；最小填充比：0.1%。

质谱测试数据用软件MaxQuant 1.5.5.1检索数据库UniProt-Camelidae-89471（版本20201019，89 471条序列）并结合反库，酶设置为不限定酶切位点：允许的最大漏切位点数量为2；一级离子质量容差为20 mg/kg；二级离子质量容差为0.1 Da；动态修饰为M氧化修饰；可信蛋白质的筛选标准为≤0.01。

1.4.5  多肽的呈味活性预测

BIOPEP-UWM是一个开放的数据库资源（https：//biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/），可用于预测已经鉴定的鲜味肽的潜在生物活性。通过查询数据库，确定了目标肽序列中具有的特定味觉活性片段的数目和氨基酸残基的数目。通过分析和计算获得目标肽中生物活性片段的出现频率，以此来预测其味觉活性。

1.4.6  感官评价

1.4.6.1  小组培训

参考Ruan等[18]的方法并略作改动。感官评价小组由10名实验室成员组成（5男5女，年龄在23～28岁之间）。小组成员均健康、不吸烟、无味觉和嗅觉障碍。小组成员经过感官训练后，可以准确识别5种基本味道，包括酸味、甜味、苦味、咸味和鲜味。小组成员被要求通过训练后才能评价以下标准味觉溶液：甜味蔗糖溶液（10 mg/mL）、鲜味味精溶液（3.5 mg/mL）、咸味NaCl溶液（3.5 mg/mL）、苦味异亮氨酸溶液（2.5 mg/mL）、酸味柠檬酸溶液（0.8 mg/mL）。此浓度的标准溶液被认定为5分。要求小组成员评价鸡肉水提物各级分离纯化组分的不同滋味特征，选择鲜味最强的组分以供进一步研究。具体感官评价标准细则见表1。

1

2

3

4

5

6

7

所有感官试验均在（25±2） ℃的环境中进行。这些样品溶解在超纯水中，转移到一个塑料杯中，并随机命名。为了避免在感官评价过程中小组成员疲劳和残留的气味，在评价两个不同的样品之间，小组成员被要求用50～60 mL的超纯水漱口至少2次。

1.4.6.2  凝胶过滤色谱分离组分感官评价

参考梁佳明等[19]的方法并略作改动。将凝胶过滤色谱各分离组分用超纯水配成5 mg/mL的溶液，每次取5 mL，按超纯水和待测液体积比为1∶1逐步稀释。将稀释好的样品按照浓度递减的顺序给感官小组人员，每个样品品尝约5 s。在对每个样品评价后漱口，再品尝下一样品。为避免感官疲劳和上一样品在口中遗留的影响，提供2个空白对照品（超纯水）进行比较。直到感官人员刚好能区分某一稀释水平的溶液与两个空白样之间的味道差异，记录此时的稀释倍数，即为稀释因子。对评价人员的评价结果进行记录（4/5以上人数的结果为可靠，这里指8人），评价过程中不允许讨论和交流，结果取3次重复试验的平均值。同时，小组成员还对各组分的味觉特征进行了描述。

1.5  数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 26.0软件处理数据，采用Origin 2018软件绘图。

2  结果与分析

2.1  盐津乌骨鸡肉水提物超滤分级与感官分析

由图1可知，随着盐津乌骨鸡肉水提物的逐步超滤分级，分离组分的鲜味逐渐增强；与U1组分相比，U3组分表现出较强的鲜味强度（P<0.05），U3组分较U1组分甜味稍高但无显著性差异（P>0.05），而在咸味强度上U3组分表现较高，与U1组分相比具有显著性差异（P<0.05）。这与前人的研究结果一致，温志鹏[20]发现随着海带酶解液的逐级分离，分离组分的鲜味、咸味的呈味强度逐渐增强，而甜味和咸味可以促进鲜味的感知。研究表明，小分子量组具有更强的鲜味，Liang等[21]将猪骨汤和猪骨洋葱汤超滤后发现，分子量低于1 000 Da的组分均具有较高的鲜味强度。因此，收集鲜味最强的组分U3，进行下一步的分離纯化。

2.2  超滤组分的凝胶过滤色谱分离与感官分析

盐津乌骨鸡肉水提物经过超滤后，已经去除了大部分分子量大于1 000 Da的肽段，但是部分肽段超滤不完全，U3组分仍是一个复杂的混合肽样品，为了进一步缩小目标鲜味肽的分子质量范围，使用凝胶过滤色谱对U3组分进一步分离纯化。

由图2中A可知，Sephadex G-15具有良好的分离效果，并且可以有效地收集不同的组分，一共分离得到4个组分（F1、F2、F3、F4），将4个组分单独分开收集，冻干后进行感官分析。由图2中B可知，F1具有较强的鲜味和咸味（P<0.05），鲜味强度甚至超过了标准溶液。F1组分的甜味稍高但与其他组分无显著性差异（P>0.05）。由于鲜味、咸味和甜味之间的相互作用，咸味和甜味可以增强鲜味[22-23]。

由表2可知，F1组分的稀释因子较高，达到512，表明F1组分具有较强的鲜味，与感官雷达图结果一致。并且随着组分不断分离，咸味强度逐渐减弱，苦味强度逐渐增强，这可能是因为凝胶过滤有一定的脱盐效果，而鲜味和甜味的减弱也逐渐使苦味暴露出来。综合以上感官分析结果，将F1组分用于后续肽的鉴定。

2.3  LC-MS/MS分离鉴定盐津乌骨鸡肉中的肽

通过LC-MS/MS鉴定F1组分中肽的氨基酸序列和对分子质量进行分析，统计结果见表3。F1组分中共含有921条肽段，其中分子量<1 000 Da的肽段最多，共有569条，占比61.78%；其次是分子量在1 000～1 500 Da范围内的肽，共有287条，占比31.16%。其余部分为分子量>1 500 Da的多肽。从氨基酸数量来看，含有3～10个氨基酸的肽段最多，有681条，占比73.95%；其次是含有11～15个氨基酸的肽段，有205条，占比22.26%；余下少量的是含有大于15个氨基酸的多肽。

此外，本次试验还统计了921条多肽中每种氨基酸出现的数量，见图3。

有3 334个亲水性氨基酸，3 120个疏水性氨基酸；出现数量最多的前五种氨基酸分别是2种亲水性氨基酸：赖氨酸（752个）和谷氨酸（610个）；3种疏水性氨基酸：脯氨酸（704个）、缬氨酸（553个）和甘氨酸（478个）。疏水性氨基酸和亲水性氨基酸出现的数量比例为1∶1.06。研究表明，肽的鲜味强度与其氨基酸的亲水性和疏水性高度相关，其中亲水性氨基酸通常与甜味和鲜味相关，而疏水性氨基酸则与不愉快的味道相关，如苦味[24]。相反，从整体的感官表现来看，疏水部分不会削弱鲜味，反而会赋予肽一定的鲜味，因此，疏水部分也是鲜味肽的重要组成部分[25]。

对分离纯化得到的多肽采用MaxQuant软件进行分析，已知测试的质谱数据和数据库中的数据越吻合，得分越高，去除解谱得分低于20的多肽，剩余617条多肽。有研究表明，目前已报道的鲜味肽的相对分子质量大多低于1 500 Da，且具有鲜味特性的中长链多肽数量更多，远超过短肽数量[26—28]。因此，进一步筛选去除了分子量大于1 500 Da和氨基酸数量大于15个的多肽，最后剩余551条多肽。组成鲜味肽的主要氨基酸是鲜味氨基酸，如天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺，在呈现多肽的鲜味方面具有重要作用。张佳男等[29]对近年来报道的鲜味肽进行了统计分析，发现含有鲜味氨基酸的鲜味肽数量占比最多，约为79%。此外，甜味氨基酸（如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸）在呈现鲜味的过程中与其他味道有一定的协同作用[24]。因此，可以将多肽中的鲜味和甜味氨基酸组成片段作为筛选条件进一步筛选。

2.4  盐津乌骨鸡肉中鲜味肽的活性预测

为了进一步筛选鲜味肽，对剩余的551条多肽进行活性片段预测分析。鲜味活性片段出现频率>1的多肽共10个，见表4。对这10个潜在的鲜味肽进行分析和下一步试验。

注：“－”表示目标肽序列中不具有相应的味觉活性片段；肽段的综合得分越高，表明鉴定结果越可信。

由表4可知，10个肽段都出现了较高的鲜味活性片段，鲜味肽的味觉活性主要归因于带电基团（正负）之间的相互作用，碱性氨基酸和酸性氨基酸共同作用产生鲜味[30]，而这10个肽段均含有Glu和Asp，也是酸味活性片段出现的主要原因[31]。对目前已经报道的鲜味肽进行分析发现，一些具有苦味的氨基酸如脯氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸等均是鲜味肽的组成成分[32]。因此，不能片面地认为含有苦味活性片段会削弱鲜味肽的鲜味。其中DTEEVEHGEE、EVHEEEVH、HEAEEVHEE、HEKLSEESEE、KVED、TPIPDLP同时出现了咸味和甜味活性片段。有研究表明，甜味和咸味氨基酸对鲜味有很好的促进作用[25]，这6个肽段可能具有较强的鲜味，同时其可信度也较高。这6条肽的二级质谱图见图4，分子质量分别为1 172.45，1 006.44，1 107.45，1 215.53，489.24，751.41 Da。但是，仅凭生物活性片段预测不能直接确定肽的味觉活性，因而在后续的研究中有必要对多肽进行合成，进一步验证肽的味觉特征。

3  结论

盐津乌骨鸡水提物经过超滤、凝胶过滤色谱分离纯化，得到鲜味最强的多肽组分F1。采用LC-MS/MS技术进一步鉴定出F1中含有921条多肽，以软件解谱得分、肽分子量和氨基酸数量为指标筛选后剩余551条多肽。通过活性片段预测得到10条鲜味片段出现频率最高（片段出现频率>1）的多肽，对10条多肽进行活性片段和氨基酸组成分析，表明DTEEVEHGEE、EVHEEEVH、HEAEEVHEE、HEKLSEESEE、KVED、TPIPDLP 6条肽可能具有较强的鲜味。本研究填补了在盐津乌骨鸡鲜味肽方面的研究空白，为下一步合成肽的呈味特性研究奠定了基础。

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