杏鲍菇菌糠循环利用安全性研究

陈芙蓉,韩宇,尹娇,王小艳,王小蓉,邓毅书

1(云南农业大学 资源与环境学院,云南 昆明,650201)2(陆良爨乡绿圆菇业有限公司,云南 陆良,655601)3(云南农业大学 建筑工程学院,云南 昆明,650201)

食用菌菌糠(spent mushroom substrates, SMS)又叫废菌料、菌渣[1],是食用菌子实体采收后的栽培废料。我国是食用菌栽培大国,2020年我国食用菌总产量达4 133.96万t(鲜重),总产值3 475.63亿元[2],占世界食用菌总产量的70%以上[3],在种植业中仅次于粮食、蔬菜、果品、油料。每年产生的菌糠总量就达1亿t以上[4],随之而来的是对培养原材料需求的急剧增长,同时,随着食用菌产业的不断壮大,菌糠数量越来越多,菌糠成为了一种可再利用的资源,因此菌糠能否安全循环利用于食用菌栽培,对此开展深入研究就显得十分必要。杏鲍菇菌糠是栽培杏鲍菇之后的培养料,随着食用菌产业的发展,杏鲍菇工厂化生产普及,杏鲍菇2020年产量排在全国第5位,年产213.47万t[5],目前生产中的主要栽培原料是棉籽壳、木屑和甘蔗渣等,棉籽壳成本偏高,甘蔗渣易受地域限制,这些对食用菌产业带来不小的困扰。目前工厂化杏鲍菇栽培中大多只收获一潮菇,杏鲍菇菌糠中的丰富的蛋白质及其他营养成分未得到充分利用。据研究杏鲍菇菌糠中粗蛋白、粗纤维、木质素、氨基酸、钙及磷等营养物质含量丰富[6],汞、镉和铅等重金属含量较低[7],具有重新作为栽培基质[8]、菌糠饲料或有机肥的潜力[6,9]。目前,杏鲍菇菌糠作为食用菌栽培基质已有一定的研究报道[10-11]。菌糠中含有重金属,而重金属的超标可能造成二次利用栽培作物、或施用土地的污染,食用菌具有富集重金属的能力[9],其可以降解含有重金属的有机物,并将它们作为养分吸收。富集的重金属能通过污染的食用菌子实体进入人体,对人类健康构成巨大威胁因此对食用菌中重金属进行检测和质量安全风险评估具有一定的社会意义和商业价值[12]。有研究表明,杏鲍菇菌糠虽然营养物质丰富,但并不是对所有的食用菌菌丝的生长均有利,如杏鲍菇菌糠水提取液对白灵菇、杏鲍菇的菌丝生长没有影响[13],但对灵芝、真姬菇、秀珍菇和平菇菌丝生长具有不同程度的抑制作用[14]。这可能是由于杏鲍菇菌糠中存在一些次生代谢物质,对食用菌的生长存在化感作用。因此,杏鲍菇菌糠若作为栽培基质循环利用需要进行较系统的研究,才能将庞大的菌糠安全合理地作为栽培基质循环利用于食用菌生产,成为一种有效资源,缓解食用菌产生的原材料困境及降低生产成本[9]。而且在实现资源充分利用的同时也满足农业生态的良性循环。因此本研究开展了菌糠中的重金属含量的检测与分析,分别用杏鲍菇菌糠的水提液和醇提液对杏鲍菇(Pleurotuseryngii)、平菇(Pleurotusostreatus)、金针菇(Flammulinavelutiper)3种食用菌菌丝体生长的化感作用开展试验,评价杏鲍菇菌糠作为培养基质循环利用时的安全性,为杏鲍菇菌糠循环再利用栽培食用菌提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

供试食用菌品种为平菇(Pleurotusostreatus)、杏鲍菇(Pleurotuseryngii)、金针菇(Flammulinavelutiper),云南省陆良县爨乡绿圆菇业有限公司。

1.1.2 杏鲍菇菌糠

杏鲍菇菌糠为一潮菇后样品,云南省陆良县爨乡绿圆菇业有限公司。杏鲍菇培养基料为玉米芯40%、桑枝木屑13%、甘蔗渣12%、麦麸17%、豆粕7%、玉米粉7%、石灰2%、轻质CaCO32%,以上均为质量分数。

1.1.3 栽培原料

供试原料:玉米芯、桑枝木屑、甘蔗渣、麦麸、豆粕、玉米粉、棉籽壳、石灰、轻质CaCO3;杏鲍菇菌糠原培养基料为玉米芯40%、桑枝木屑13%、甘蔗渣12%、麦麸17%、豆粕7%、玉米粉7%、石灰2%、轻质CaCO32%,以上均为质量分数,云南省陆良县爨乡绿圆菇业有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 化感效应试验

试验按体积分数0%、30%、40%、50%、60%、70%的比例分别加入杏鲍菇菌糠水提液、醇提液制作培养基,共设计6个处理(CK、30、40、50、60、70),每个处理3次重复,分别对杏鲍菇、平菇、金针菇菌株进行培养。

1.2.2 不同杏鲍菇菌糠替代量栽培平菇试验

试验所有处理设置碳氮比均为20∶1,按不同菌糠替代量(0%、30%、40%、50%、60%、70%)共设计6个处理(CK、E1、E2、E3、E4、E5),每个处理3次重复,每个重复样本5袋,进行栽培试验。具体配方设计见表1。

表1 不同杏鲍菇菌糠替代量栽培平菇试验设计 单位:%

1.3 试验方法

1.3.1 杏鲍菇菌糠营养成分测定

菌糠中酸不溶木质素、酸溶木质素、纤维素、半纤维素检测参照NY/T 3494—2019《农业生物质原料 纤维素、半纤维素、木质素测定》;粗蛋白的检测方法参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》;脂肪的检测方式参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》;淀粉的检测方式参照GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》;菌糠中总糖的检测方式参照GB 15672—2009《食用菌中总糖含量的测定》。

1.3.2 杏鲍菇菌糠水提取液的制备

水提液的制备参照赵玉卉等[15]的方法,选取干燥、无霉变的杏鲍菇菌糠粉碎至40目过筛,采用四分法将样品缩减至200 g,加水1 000 mL,煮沸20 min,用6层纱布过滤,补水至1 000 mL。

1.3.3 杏鲍菇菌糠醇提液的制备

按李挺等[16]的方法选取干燥、无霉变的杏鲍菇菌糠试样,粉碎至40目,用四分法将试样缩减至200 g,加无水乙醇1 000 mL,浸泡过夜,将上清液旋转蒸发,回收乙醇再浸泡菌糠过夜,重复2次,得到杏鲍菇菌糠醇提膏状物,加水1 000 mL,制成浑浊液。

1.3.4 平板培养基的制备

按李挺等[16]的方法取马铃薯200 g洗净去皮,切成小块,分别按体积分数0(对照)、30%、40%、50%、60%、70%加入杏鲍菇菌糠水提液、醇提液,煮沸30 min,用纱布过滤,滤液加入琼脂20 g,煮沸溶解后加葡萄糖20 g,或用水补至1 000 mL,得到10种不同的平板培养基,以PDA培养基为对照处理,分装于500 mL三角瓶里,115 ℃灭菌20 min,冷却至常温备用,每个处理3次重复。

1.3.5 培养

按李挺等[16]的方法在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入口径为9.0 cm的无菌培养皿中,每皿约10 mL,摇匀并冷却制成平板。取在PDA试管培养基上培养好的3种食用菌菌丝体,分别转接到平板培养基上,倒置于培养箱中,25 ℃暗照培养,记录菌丝萌发时间,待菌丝萌发后,每隔24 h观测菌丝生长状态,并用十字交叉法测定菌落直径,取平均值。

1.3.6 杏鲍菇菌糠及平菇子实体重金属含量测定

杏鲍菇菌糠中的重金属均参照HJ 766—2015《固体废物 金属元素的测定 电感耦合等离子体质谱法》中电感耦合等离子体质谱法测定,平菇子实体中的重金属检测参照GB 5009.12—2023《食品安全国家标准 食品中铅的测定》、GB 5009.17—2021《食品安全国家标准 食品中总汞和有机汞的测定》和GB 5009.11—2014《食品安全国家标准 食品中总砷和无机砷的测定》、GB 5009.15—2023《食品安全国家标准 食品中镉的测定》中电感耦合等离子体质谱法(仪器型号为ICP-MS:Aglient 7800)测定。

1.3.7 栽培方法

1.3.7.1 菌袋的制备及接种

按照试验设计表1分别称取试验材料,将栽培基质拌匀后,调节含水量为65%～68%,用聚丙烯塑料袋(25 cm×13 cm)人工装袋制作菌包,每袋菌包湿重为1.5 kg,平菇菌袋用报纸、橡胶圈封袋(从拌料到装袋的整个过程应当在6 h之内完成),于121 ℃,0.1 MPa高压蒸汽锅中灭菌8 h,待自然冷却至室温后,无菌转移至超净工作台,用75%(体积分数)酒精表面消毒后移入超净工作台中,用消毒后的镊子分别将菌种接种到菌包中央预留孔穴中后封袋,每接种5袋对工具进行消毒。

1.3.7.2 发菌

接种后的菌包,控制温度为25 ℃,空气湿度为60%～70%,通风、避光条件下置于培养房中培养发菌。

1.3.7.3 出菇管理

平菇待菌丝长满菌袋,发菌结束后,挑选长势一致的菌袋运至出菇棚内。棚内地面垫编织袋,将菌袋摆于其上,提高空气湿度,现蕾后去除封口报纸,每天用喷雾壶喷洒2～3次、保持通风。待平菇子实体菌盖边缘内卷,菌柄中实,手感密实,颜色由深逐渐变浅,未弹射孢子前及时采收。

1.4 指标测定

1.4.1 化感效应指数计算

观察、记录菌丝萌发时间,菌丝萌发后每隔24 h观测菌丝生长状态,并用十字交叉法测定菌落直径,取平均值,同时记录菌丝长势及菌丝颜色。化感效应指数(response index, RI)按照BRUCE WILLIAMSON等[17]提出的方法计算,其计算如公式(1)所示:

(1)

式中:C,对照值(CK),T,处理值。RI>0表示促进作用,RI<0表示抑制作用,RI绝对值大小反应化感作用的强度。“+++”表示菌丝生长浓密健壮,“++”表示菌丝生长较浓密,“+”表示菌丝生长[15]。

1.4.2 平菇产量的测定

将采摘的平菇用电子天平称量鲜重,记录数据,计算每个处理的产量。

1.5 数据处理统计及处理

试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理,各组间数据比较采用单因素方差分析,显著性水平为0.05,作图采用Origin 2021软件。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇菌糠中的营养成分

杏鲍菇菌糠中的木质素、纤维素、半纤维素、粗蛋白、脂肪、淀粉、总糖含量如表2所示。由表2可知,采收一潮菇后的杏鲍菇菌糠中木质素、纤维素、半纤维素分解不完全,其中酸不溶木质素平均含量22.01%、酸溶木质素平均含量22.66%、纤维素平均含量25.13%、半纤维素平均含量36.39%。并且菌糠中的营养成分未得到充分利用,其中,粗蛋白13.24%,淀粉10.78%,总糖含量2.55%。由此可见,杏鲍菇菌糠具备作为食用菌栽培基质循环利用的营养条件。

表2 杏鲍菇菌糠中养分含量 单位:%

2.2 杏鲍菇菌糠提取液对菌丝萌发及生长的影响

2.2.1 杏鲍菇菌糠水提液对菌丝萌发及生长的影响

杏鲍菇菌糠水提液对平菇菌丝萌发及生长的影响如表3、图1所示,由表3、图1可知,不同浓度的杏鲍菇菌糠水提液对平菇、杏鲍菇和金针菇的菌丝萌发与对照相比无显著差异,均在2～3 d内萌发,不同浓度的水提液对同一种菌的菌丝萌发无影响,萌发时间相同,平菇和杏鲍菇均为2 d,金针菇为3 d;与CK相比,不同浓度的水提液对杏鲍菇和金针菇的菌丝生长速度影响无明显差异,30%～70%体积分数杏鲍菇菌糠水提液对平菇和杏鲍菇菌丝生长无明显抑制作用,70%时生长最快,平菇菌丝生长速度为11.01 mm/d,化感效应指数达到最高为9.55%,杏鲍菇菌丝生长速度为10.12 mm/d,化感效应指数达到最高为59.62%,杏鲍菇菌糠水提液体积分数30%～40%时对金针菇菌丝生长具有一定抑制作用,体积分数在60%抑制作用最强,化感效应指数为-21.08%;不同浓度杏鲍菇水提液对3种菌的菌丝长势与CK相比无明显差异,杏鲍菇菌糠水提液在体积分数30%～70%时,平菇、杏鲍菇菌丝长势好,菌丝浓密、粗壮,添加体积分数为70%时长势最好。

图1 杏鲍菇菌糠水提液对平菇、杏鲍菇、金针菇菌丝生长的影响Fig.1 Effect of water extract of spent P. eryngii substrates on mycelial growth of P. ostreatus, P. eryngii and F. velutipes

表3 杏鲍菇菌糠水提液对菌丝生长的影响Table 3 Effect of water extract of spent P. eryngii substrates on mycelial growth

由此可知,杏鲍菇水提液对平菇和杏鲍菇的菌丝萌发和生长速度及长势无抑制作用,在提取液浓度为70%对菌丝和生长速度及长势促进作用明显;水提液对金针菇的菌丝萌发无影响,低浓度时对菌丝生长速度和长势影响不明显,但浓度达到50%时即产生抑制作用,且抑制作用随着浓度的增加而增强。

2.2.2 杏鲍菇菌糠醇提液对菌丝萌发及生长的影响

不同浓度杏鲍菇菌糠水提液和醇提液对平菇菌丝生长的影响如表4、图2所示,与CK相比,杏鲍菇醇提液对平菇和杏鲍菇的菌丝萌发有明显的抑制作用,均慢于CK,所有处理平菇均比CK晚2 d,杏鲍菇比CK晚1 d,对金针菇的菌丝萌发无影响;醇提液对3种菌的菌丝的生长速度和长势与CK相比抑制作用明显,差异显著,且浓度越高抑制作用越明显,随着浓度的升高,平菇和杏鲍菇菌丝的生长速度急剧下降,浓度为70%时,平菇菌丝生长速度降为1.59 mm/d,化感效应指数达到-79.87%,杏鲍菇菌丝生长速度降为2.55 mm/d,化感效应指数达-74.63%,菌丝稀疏;添加杏鲍菇菌糠醇提液对金针菇菌丝的生长也表现为抑制作用,但抑制强度弱于平菇和杏鲍菇,浓度为40%时抑制作用最强,化感效应指数为-16.93%,菌丝稀疏。

图2 杏鲍菇菌糠醇提液对平菇、杏鲍菇、金针菇菌丝生长的影响Fig.2 Effect of alcohol extract of spent P. eryngii substrates on mycelial growth of P. ostreatus, P. eryngii and F. velutipes

表4 杏鲍菇菌糠醇提液对菌丝生长的影响Table 4 Effect of alcohol extract from spent P. eryngii substrates on mycelial growth

由此可见,杏鲍菇菌糠醇提液对平菇、杏鲍菇的菌丝萌发有明显的抑制作用;对平菇、杏鲍菇和金针菇的菌丝生长速度和长势有明显的抑制作用,且随着醇提液浓度的增加抑制作用增强,对金针菇的抑制作用弱于平菇和杏鲍菇。

2.3 杏鲍菇菌糠中重金属安全性分析

为研究浓缩效应是否会导致杏鲍菇菌糠中重金属含量增加,以及是否会影响其作为食用菌栽培基质循环利用的安全性,通过对杏鲍菇菌糠进行重金属检测及对其他菌糠研究数据的整理分析,菌糠重金属含量见表5。对平菇子实体中重金属含量进行检测及对其他利用菌糠栽培的杏鲍菇、金针菇、香菇、黑木耳中重金属含量的研究数据整理分析结果如表5所示。

表5 废弃菌糠重金属含量 单位:mg/kg

由表5可知,平菇、香菇、金针菇、黑木耳、秀珍菇、茶树菇菌糠的As、Hg、Pb、Cd、Cr 5项指标均显著低于NY/T 525—2021《有机肥料》规定的安全限值,表明杏鲍菇菌糠中的重金属含量均能符合要求,在重金属含量方面是安全的,可作为栽培基质二次利用,不会对食品、环境造成风险。

由表6可知,虽然不同食用菌对同种重金属的累积能力存在较大差异,但平菇、杏鲍菇、金针菇、香菇、黑木耳中Hg、Cd、As、Pb含量均远低于GB 2762—2022《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定的限量标准,不存在食品安全风险。

表6 食用菌中常见重金属含量 单位:mg/kg

由以上对菌糠中和食用菌子实体中重金属含量的检测与分析可以看出,无论是子实体还是菌糠中的重金属含量均低于国家的相关标准,因此,菌糠作为食用菌栽培基质循环利用在重金属方面是安全的。

2.4 不同杏鲍菇菌糠替代量栽培平菇经济效益分析

不同菌糠替代量栽培的平菇产量如表7所示。由表7可知,平菇总产量在菌糠替代量为30%、40%、50%时无显著差异,当菌糠替代量大于50%时总产量显著下降。根据该总产量计算栽培1 000袋平菇的经济效益,栽培原料市场价格如表8所示,平菇售卖价格按当季市场价8元/kg计算,由表9可以看出,随着菌糠替代量的增加,成本逐渐下降,收入随菌糠替代量的增加呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,处理E1、E2和E3利润分别增加13.56%、10.68%和12.47%,处理E4、E5利润下降4.83%、25.59%。

表7 不同杏鲍菇菌糠替代量栽培平菇产量Table 7 Yield of P. ostreatus cultivated with different amounts of spent P. eryngii substrates substitution

表8 栽培原料市场价格Table 8 Market prices of cultivated raw materials

结果表明,当菌糠替代量为30%时,利润较高,栽培平菇经济效益最高。考虑到菌糠回收用于二次栽培时,通过新的配方和方法对材料进行整合,具有降低生产成本和减少环境影响的双重优势,兼顾降低成本和减少环境影响,菌糠替代量为50%时,综合效果最佳。

3 讨论

经过食用菌分解、产菇、采收后留下来的培养料,其中含有丰富的脂肪、氨基酸、矿物质、菌丝残体蛋白以及菌丝体的次生代谢产物[20],多糖及铁、钙、锌、镁等矿物质含量也较丰富,还含有较多的木质素、纤维素和半纤维素。工厂化的杏鲍菇菌糠由于大多只采收一潮菇,菌糠中还有大量营养物质未得到充分利用,本研究中杏鲍菇菌糠的纤维素平均含量25.13%、半纤维素平均含量36.39%,粗蛋白平均含量13.24%,脂肪平均含量0.99%,淀粉平均含量10.78%,总糖平均含量2.55%,其所余营养成分还较多且明显高于多次采收的平菇及其他菌的菌糠,与周亚红等[21]的研究结果一致,因此杏鲍菇菌糠具备作为食用菌栽培基质循环利用的营养条件。

特定的代谢产物会对其他生物产生抑制和促进,具有化感作用的化学物质称作化感作用化合物,多是次生代谢化合物,其组成成分包括简单的气体、脂族化合物、多环芳香化合物等[22]。曾荣耀等[23]研究表明食用菌菌糠中除了丰富的营养物质外还含有菇类、类脂等一些次生代谢物质,而这些次生代谢物质可能会不利于食用菌菌丝的生长。本研究中杏鲍菇菌糠水提液对平菇和杏鲍菇的菌丝萌发和生长速度及长势无抑制作用,对金针菇的菌丝萌发无影响,但浓度达到50%时对菌丝生长速度和长势产生抑制作用,该结果与李挺等[16]的研究结果一致;杏鲍菇菌糠醇提液对平菇、杏鲍菇的菌丝萌发有明显的抑制作用,随浓度的增加,抑制作用增强。杏鲍菇菌糠水提液对平菇和杏鲍菇的菌丝萌发和生长无抑制而醇提液有显著抑制的的现象可能是菌糠中某些成分与醇类物质发生了发应,生成了具有抑制作用的脂溶性化感物质。杏鲍菇菌糠水提液对金针菇的生长有抑制作用,杏鲍菇菌糠醇提液对金针菇的抑制作用弱于平菇和杏鲍菇,与张国广等[14]研究一致,原因可能是亲缘关系较近的菌物具有特定元素吸收利用偏好性特征。因此,由于杏鲍菇菌糠作为栽培基质循环利用时没有有机溶剂的加入,用作平菇和杏鲍菇的栽培基质是不会产生抑制作用,是安全的。

由于浓缩效应会导致重金属在菌糠中产生富集,且食用菌具有富集重金属的能力,其可以降解含有重金属的有机物,并将它们作为养分吸收。富集的重金属能通过污染的食用菌子实体进入人体,对人类健康构成巨大威胁,因此对食用菌中重金属进行检测和质量安全风险评估十分必要[12]。本研究中对常见食用菌菌糠及子实体重金属含量进行了检测和统计分析,结果表明无论是子实体还是菌糠中的重金属含量均低于国家的相关标准,与饶书恺等[18]的研究一致,一般来说菌糠作为食用菌栽培基质循环利用在重金属方面是安全的,大多数食用菌产品重金属含量均符合国家标准,安全性较高。但这是基于新鲜原材料的重金属含量本身就低于国家标准,且即使是在发生浓缩效应后含量依然低于国家标准,是安全的。

平菇产量在菌糠替代量达50%之前,产量无显著差异,但均高于对照,可能是由于蘑菇的生态生境和生长营养需求之间的差异,食用蘑菇分为初级分解者和次级分解者,杏鲍菇作为初级分解者,其分解、产菇、采收后留下来的培养料中含有丰富的脂肪、氨基酸、矿物质、菌丝残体蛋白以及菌丝体的次生代谢产物,还含有较多的木质素、纤维素和半纤维素,而平菇作为次级分解者,能分解已经被一级分解者部分分解的有机物;替代量超过50%,产量会下降,且低于对照,可能是和碳源供给有关,在所有的营养物质中,碳源最为重要,菌体成分中50%～65%为碳素,碳代谢不仅为食用菌碳水化合物和氨基酸的生物合成提供原料,还是维持食用菌生长的主要能量来源,菌糠替代量过多,有可能对碳代谢造成影响。

4 结论与展望

杏鲍菇菌糠水提液对平菇和杏鲍菇的菌丝萌发和生长没有抑制作用,杏鲍菇菌糠中的重金属含量满足国家的相关规定,因此,杏鲍菇菌糠作为平菇和杏鲍菇栽培基质循环利用是安全的,且能充分利用资源并在一定程度缓解食用菌产业的原材料来源问题和降低生产成本,但不建议用于金针菇的基质栽培,无论是水提还是醇提对金针菇的菌丝生长速度和长势都会产生抑制作用。建议在生产过程中要注重菌糠的存放条件,在堆放时要注意不要发霉发酵,以免产生有毒有害物质。

杏鲍菇菌糠提取液中的具体成分还需要进一步检测并开展深入研究,分析对菌丝的萌发和生长产生促进或抑制的具体因素,明确其作用机理,为菌糠的安全高效广泛利用提供科学依据。