诺丽对冠部牙本质粘接强度及纳米渗漏的影响

周可莹， 李艳萍， 李海清， 何丽娜， 潘爽， 牛玉梅

1. 哈尔滨医科大学附属第一医院，哈尔滨医科大学口腔医学院，黑龙江 哈尔滨（150000）； 2. 黑龙江省医院口腔医学中心，黑龙江 哈尔滨（150036）

有效的根管清理、成形以及充分的根尖封闭对牙髓治疗的成功至关重要，而根管治疗后的冠部修复则是防止细菌渗透的基础，不仅能重建牙齿的美观和功能，还能够避免剩余牙齿结构的折裂。越来越多研究证实，完善的冠部修复是保障根管治疗疗效的关键因素［1］。牙本质的粘接可能受到许多因素的影响，根管预备过程中使用的化学冲洗剂可能会改变牙本质的表面成分，并影响其与冠部封闭材料之间的相互作用［2］。目前临床上使用最广泛的根管冲洗液是NaClO，它可以溶解坏死的牙髓组织、去除根管内的微生物，并且能在根管预备过程中润滑根管壁［3］；乙二胺四乙酸盐（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）通常作为辅助冲洗液与NaClO 联合使用，可以有效去除玷污层［4］。然而NaClO 会影响牙本质表面的钙/磷（Ca/P）比，进而改变牙本质的渗透性和溶解性［5］，并且其对冠部牙本质粘接强度的影响在不同的研究中因浓度、处理时间和方法不同，结论并不一致［6］。

由于传统根管冲洗液存在一定的局限性，具有抗菌作用的中草药产品诺丽（Morinda citrifolia juice，MCJ）被广泛关注，课题组前期研究表明：MCJ 的抗菌性与NaClO 没有显著性差异，且MCJ 发挥显著抑菌作用的最低浓度为6%［7］；MCJ 比NaClO对人牙周成纤维细胞和人根尖乳头干细胞的牙源性分化以及对细胞增殖和迁移的影响更小［8］；MCJ与EDTA 联合冲洗有助于去除玷污层［9］。本研究在课题组前期研究的基础上，研究MCJ 联合EDTA根管冲洗对冠部牙本质粘接强度及纳米渗漏的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料与设备

复合树脂Z350（3M ESPE，美国）；Single Bond Universal 第八代通用型粘接剂（3M ESPE，美国）；2.5%NaClO、5.25%NaClO、17%EDTA（朗力，中国）；诺丽粉（海南百舒堂生物科技开发有限公司，中国）；电子万能试验机（2620-601，Instron，美国）；低速金刚石切割机（SYJ-160，沈阳科晶有限公司，中国）；体视显微镜（M50，Leica，德国）；扫描电子显微镜（SU5000，日立，日本）

1.2 样本选择与收集

本研究获哈尔滨医科大学医学伦理专家委员会批准（批号：IRB-AF/SC-04/02.0）。收集因正畸需要而新鲜拔除的63 颗无龋前磨牙，所有患者均同意参加研究并签署知情同意书。清除牙齿表面软组织，4 ℃下浸泡在0.9%生理盐水保存，1 个月内使用。

1.3 离体牙的制备和分组

将63 颗离体前磨牙牙根包埋在边长1.5 cm 的立方形硅胶体中的超硬石膏中，用低速切割机切除2 mm 的表面釉质，完全暴露出牙本质平面，在流动水下依次用400、600、800、1 000 目的砂纸打磨牙本质面以形成标准玷污层。

根据冲洗液不同实验分为对照组（蒸馏水组）和6 个实验组，实验组包括：A 组2.5% NaClO、B 组5.25% NaClO、C 组6% MCJ、D 组2.5% NaClO-17%EDTA、E 组5.25% NaClO-17% EDTA 和F 组6%MCJ-17% EDTA，每组9 个牙本质试件，分别用相应冲洗液浸泡20 min，其中冲洗液每5 min 更换1 次以模拟根管治疗时冲洗到冠部牙本质的情况，D、E、F 组分别在每次更换液体后，浸泡在17% EDTA溶液中15 s，再用蒸馏水冲洗2 min。每个样本按说明书要求涂布第八代3M 自酸蚀粘接剂，并分层堆砌长3 mm、宽4 mm、高4 mm 的Z350 树脂块。

1.4 微拉伸粘接强度测试

每组随机选取6 个样本，用低速切割机在流动水冷却下切割成粘接面积约为1 mm2的树脂-牙本质试件条，每个试件约1 mm × 1 mm × 8 mm，排除有裂纹、破损的试件后，每组获得6 个条状试件。将试件条通过氰基丙烯酸粘接剂固定在夹具上，用电子万能试验机连接到计算机，设置十字头加载的速度为0.5 mm/min，样本断裂后，将样本从夹具中取出，同时记录断裂时的最大载荷值（N），并计算以MPa 表示的极限微拉伸粘接强度。计算公式为：微拉伸粘接强度（MPa）=最大载荷（N）/试件截面积（mm2）。

1.5 断裂模式分析

体视显微镜在放大10 倍下观察断裂后的条状试件，以确定断裂模式。其中包括：①牙本质内聚破坏；②树脂内聚破坏；③粘接界面破坏；④混合破坏（包括前三种类型中的任意组合）。

1.6 纳米渗漏测试

1.3 实验中每组剩余的3 个样本用于纳米渗漏检测。将各组样本在10%NaClO 水溶液中1 h 模拟老化［10］。在流水下，用低速切割机将样本沿牙体颊舌向，切割成厚度约1 mm 的薄片，每组随机选取5 个薄片，在距离粘接界面上下1 mm 以内的区域均匀涂布无色透明指甲油，待干燥后重复两次。将样本在避光完全黑暗的状态下浸没在50%氨化硝酸银溶液（pH=9.5）中24 h。24 h 结束后，取出样本在流水下冲洗5 min，并在荧光灯下置于显影液中8 h，以将银离子还原成金属银颗粒，随后定影液中固定8 h，再次冲洗5 min。对样本轻轻抛光去除表面银残留，干燥后场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）背散射模式下观察粘接界面，以对银离子进行定量分析。每个薄片状样本随机选取3 个视野。将获得的图像于粘接界面处裁剪成相同的面积（包括混合层及粘接剂部分区域，分辨率为1 200 像素× 200 像素），使用数字图像分析软件Image J 分析金属银颗粒在粘接界面的分布。使用能量色散X 射线光谱仪（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）面扫分析粘接界面各元素分布情况，包括Si 元素（树脂）、Ag 元素（纳米渗漏）、Ca 元素（牙本质）。

1.7 粘接界面观察

从1.6 实验余留样本中每组随机选取3 个薄片样本，依次用800、1 000、1 500 目砂纸在流动水下打磨抛光，37%磷酸酸蚀粘接面30 s，5% NaClO 中浸泡2 min，梯度乙醇依次脱水，干燥，喷金60 s，扫描电子显微镜下观察粘接界面。

1.8 统计学分析

所有数据均使用SPSS 26.0 软件进行统计处理，连续性资料符合正态分布和方差齐性，在多组进行单因素方差分析和LSD 两两比较，以P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 微拉伸粘接强度测试结果

微拉伸粘接强度测试结果如表1 所示，对照组粘接强度最高。实验组中B 组粘接强度最低（P＜0.05），F 组粘接强度最高（P＜0.05）。使用EDTA的D、E、F 组的粘接强度显著高于相应单一冲洗液的A、B、C 组（P＜0.05）。

表1 各组微拉伸粘接强度测试结果比较Table 1 Comparison of the test results of the microtensile bond strength in each group

2.2 断裂模式分析

各组断裂模式类型及断裂频数见表2，各组多以混合型破坏为主，相同作用时间下，NaClO 浓度越高，粘接界面破坏频率越大。图1 为体视显微镜下典型断裂模式。

图1 不同断裂模式的体视显微镜图（×10）Figure 1 Visual microscopy image of the fracture pattern in each group (×10)

表2 各组断裂类型及断裂频数Table 2 Break type and fracture frequency of each group n (%)

2.3 纳米渗漏测试结果

选定区域代表性纳米渗漏SEM及EDX图像如图2 所示，其中Si 元素主要分布在树脂内，Ca 元素主要分布在牙本质内，Ag 元素主要分布在粘接面内。

图2 纳米渗漏实验中树脂-牙本质粘接界面的典型扫描电镜图像（×1 000）和能量色散X 射线光谱仪能谱分析图像Figure 2 Typical SEM image (×1 000) and EDX spectral analysis image of the resin-dentin adhesive interface in the nanoleakage experiments

树脂-牙本质界面以及混合层和牙本质小管内银颗粒渗透的平均百分比见表3。所测试的树脂-牙本质粘接界面均呈现不同程度的纳米渗漏，且各组间纳米渗漏值均有显著性差异（P＜0.05）。实验组中B 组银渗透率最高（P＜0.05），F 组银渗透率最低（P＜0.05）。

表3 各组纳米渗漏银渗透率结果比较Table 3 Comparison of the results of nanoleakage silver permeability in each group

图3 为各组典型的纳米渗漏图像。在不用EDTA 处理的A、B、C 组沿粘接界面观察到银沉积的连续粗线，使用EDTA 处理后的D、E、F 组观察到中等程度的银离子沉积，除对照组外F 组银离子沉积最少；随着NaClO 浓度的升高，B 组比A 组、E 组比D 组呈现出更多的银离子沉积。

图3 各组纳米渗漏的代表性背散射模式扫描电镜图像（×1 000）Figure 3 Representative backscatter pattern SEM images of nanoleakage in each group (×1 000)

2.4 粘接界面形态观察

如图4 可见扫描电子显微镜下各组的粘接界面形态，即粘接界面形成的混合层以及牙本质小管中均有长度粗细不同的树脂突。不用EDTA 处理的A、B、C 组树脂突短小，数量少，使用EDTA 处理后的D、E、F 组树脂突数量和长度均增加，除对照组外，F 组树脂突数量最多，长度最长。低浓度NaClO 作为单一冲洗液（A 组）时，混合层的树脂突短小，随着NaClO 浓度的增加，B 组比A 组、E 组比D 组树脂突形成逐渐变多、变粗且长度增加，但深部却较细且彼此无明显交联。

图4 各组树脂-牙本质粘接界面的代表性扫描电镜图像（×2 000）Figure 4 Representative SEM images of the resin-dentin adhesive interface in each group (×2 000)

3 讨 论

使用修复材料立即封闭根管治疗后的牙齿可以有效防止冠部渗漏，因此冠部永久修复体的质量是决定牙齿预后的关键因素［11］。其中复合树脂是最常用的牙体粘接修复材料［12］，树脂-牙本质粘接界面的粘接力，主要来自于二者之间形成的微机械扣锁作用［13］，树脂单体能够渗入到牙本质酸蚀后形成的松散的胶原纤维网中，从而形成致密的混合层［14］。而目前有很多研究表明，临床上最常见的根管冲洗液NaClO 不仅会改变牙本质机械强度，还可能会影响树脂牙本质粘接界面［6］。

由于NaClO 潜在的副作用［15］，具有高抗菌活性、生物相容性、抗炎和抗氧化特性等优势的中草药产品受到广泛关注［16］，研究人员就其替代传统根管冲洗剂和药物的可行性进行了多项研究［17］。海巴戟，俗称诺丽，是民间药材和保健饮品，具有广泛的治疗作用，包括抗菌、抗炎、镇痛、降血压和增强免疫特性［18］。研究表明：6%MCJ 是一种具有高抗菌功效的植物治疗试剂，可用作根管冲洗［19］；建议使用6%MCJ 作为初始冲洗液，然后使用17%EDTA，以产生与6%NaClO 和17%EDTA 联合冲洗相似的玷污层去除率［20］。但是对于其与EDTA联合应用对冠部牙本质与树脂粘接强度及纳米渗漏的影响尚未有研究。

在本研究中，实验组各组均有显著性差异，微拉伸粘接强度测试结果表明NaClO 会降低牙本质与树脂粘接强度，且浓度越高，微拉伸强度越低，这可能是因为：第一，NaClO 会造成牙本质的有机基质（主要是胶原蛋白）的损伤，并且NaClO 处理后的牙本质中可能存在一些反应性自由基，导致树脂聚合反应过早发生链终止或者不完全固化［21］；第二，NaClO 可分解成氯化钠和氧气，化学反应产生的氧气对粘接材料的界面聚合会产生抑制作用；并且还可能在树脂-牙本质界面中产生空隙，从而干扰树脂渗透到牙本质小管以及管间牙本质［22］；第三，NaClO 处理会增加牙本质表面的pH值，即使最终用水冲洗后也是如此，牙本质表面的碱性会缓冲自酸蚀粘接剂的酸性，从而降低粘接强度［23］；第四，用NaClO 冲洗后会导致牙本质降低其显微硬度、弹性模量等，从而使粘接强度下降［24］。当EDTA 作为辅助冲洗液时，去除了玷污层，各组强度均有所恢复，并且形成明显长度更长、数目更多的树脂突，这可能是因为EDTA 作为温和的螯合剂［25］，可以去除玷污层内的无机成分并选择性地保留羟基磷灰石和非胶原蛋白，从而保留更多胶原纤维内的矿物质，减少对牙本质胶原纤维的损伤，使粘接剂中的功能单体更多与牙本质结合，改善了树脂材料的渗透性，有利于提高粘接的长期稳定性［26］。MCJ 含有具有抗菌活性的生物活性化合物，此外还含有一些有机酸，如己酸、熊果酸、辛酸等，因此可能会去除些许玷污层，而这些酸也会改变牙本质的微观结构，这可能是导致MCJ 会降低牙本质与树脂粘接强度的原因［27］；与EDTA 联合应用后，粘接强度比其他实验组高（P＜0.05），牙本质表面的粘接微形态也与对照组类似，这意味着MCJ 与EDTA 联合冲洗对牙本质有机和无机成分的影响有限，小于NaClO 联合EDTA 根管冲洗对牙本质粘接产生的负面影响，故MCJ 与EDTA 联合冲洗的粘接强度大于NaClO 与EDTA 联合冲洗。

在微拉伸试件的断裂模式中，5.25%NaClO 以粘接界面断裂为主，进一步说明了粘接界面经5.25% NaClO 溶液处理后出现了应力薄弱区，而在使用EDTA 后，各组多以混合破坏占主导，粘接界面断裂的数目减少，说明了使用EDTA 后可能在一定程度上恢复NaClO 和MCJ 处理后对树脂-牙本质粘接界面产生的不良影响。实验组中，6% MCJ-17% EDTA 和2.5% NaClO-17% EDTA 组试件断裂类型以混合破坏为主，说明在界面处产生更均匀的应力分布，增加了粘接界面的稳定性。

纳米渗漏发生在纳米尺度空间的混合层内，它会导致口腔液体和细菌通过界面渗漏，从而损害牙本质和复合树脂之间键的稳定性［28］。纳米渗漏被认为是评估修复材料混合层质量和粘接耐久性的最常用的指标［29］。从纳米渗漏结果可以看到5.25% NaClO 的银渗透率最高，EDTA 加入后银渗透率下降，且MCJ 联合EDTA 组的银渗透率最低，这与微拉伸粘接强度测试结果一致，说明单独使用NaClO 会改变牙本质的表面结构，并且NaClO 分解产生的氧气不仅会阻碍树脂聚合，还有可能在粘接界面形成裂纹，产生纳米级别的渗漏通道。应用EDTA 后，不仅去除了玷污层，还增加了树脂的渗透性，减少了银渗透率。6% MCJ-17% EDTA组纳米渗漏率最低，进一步说明了MCJ 和EDTA 的联合冲洗对牙本质结构的影响较小，可以降低单独使用MCJ 冲洗产生的不良影响。

综上所述，与NaClO 相比，MCJ 联合EDTA 根管冲洗对树脂牙本质粘接界面影响较小，并且减少了冠部渗漏的风险；结合国内外研究进展及课题组前期实验，MCJ 有望成为根管冲洗液用于临床治疗。而本实验仍有一些不足，实验中样本制备使用低速切割机去除冠部牙釉质，暴露牙本质平面后进行粘接树脂块，是进行微拉伸粘接强度测试和纳米渗漏测试的常规实验方法，但这与临床上实际操作存在差异，虽然死髓牙中这种差异较小，在未来的研究中，将进行洞形的制备以期更贴近临床，且针对MCJ 临床应用的安全性进一步研究。

【Author contributions】Zhou KY designed the study, performed the experiments and analyzed the data. Li YP, Li HQ performed the experiments and analyzed the data. He LN, Pan S, Niu YM revised the article.All authors read approved the final manuscript as submitted.