纳米金层析试纸条在检验检测中的应用进展

郑连涛,张晓霞,刘佩钰,王志进,孙睿,牛晓琳,黄帅,王晓玥

(德州学院 医药与护理学院,山东 德州 253023)

1 纳米金层析试纸条的发展历程及其现状

为保障人民合法权益和生命健康,食品安全、临床诊断等各领域的检测必不可少[1-2],务必发展检测手段以起到预防和监管控制效果。20世纪80年代初,在免疫层析技术的基础上,纳米金层析试纸条检测方法被建立。Faulk等[3]最先应用此技术检测了大肠埃希菌Escherichia coli,1980年Unipath公司开始市售检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的试纸条,该试纸条通过将纳米金颗粒作为信号探针,用来检测女性是否妊娠[4]。纳米金试纸条技术的名称来源于其使用粒径在1～100 nm之间的金颗粒,与相应的特异性探针相结合后,被检测物与样品垫上的纳米金颗粒偶联,利用层析作用到达检测线,通过显色反应来检测目的物质是否存在[5]。根据检测物的不同,纳米金试纸条涵盖了核酸水平的分子生物学检测、蛋白质水平的免疫学检测、化合物水平的理化检测等多种层次。该技术具有特异性强,灵敏度高,稳定性好,检测速度快,成本低,可视化,操作简单,污染少等一系列优点,因此在环境污染检测,食品安全检测,临床诊断检测,微生物检测等领域应用广泛。

2 纳米金层析试纸条应用于微生物快速检测

2.1 纳米金层析试纸条与病毒检测

病毒无细胞结构,依靠寄生在生物体内生存,进而侵染宿主的生命系统,且带有一定的传染性。为实现对病毒病的预防和监管,需要对病毒进行准确检测。病毒检测现阶段主要依赖于PCR扩增技术[6],需要使用凝胶电泳检测结果,存在着检测时间长、操作复杂、检测结果无法直观可视等问题[7-8]。王之莹等[9]将纳米金试纸条用于PCR结果的检测,建立了侧流核酸测定试纸条(lateral flownucleic acid assay,LFNAA)检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的可视化检测方法。受PCR 技术的限制,仍无法实现现场检测,因此有多项研究在检测技术上进行突破。如赵锦等[10]将等温链置换扩增技术(Strand Displacement Amplification,SDA)与纳米金测流层析试纸条相结合,进而应用于登革热病毒(DENV)的检测。该方法使用等温扩增技术代替PCR扩增,可实现现场快速检测。

在病毒检测实验过程中,由于环境及生物体本身等影响,实验结果会不可避免地出现误差。因此在实验中,需要增加多种检测条件,使误差对实验结果的影响降到最低。宋广萍[11]以杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction,HCR)为基础,以分子信标结构探针(MBs)和双联特异性核酸酶为辅助,避免了多种干扰,同时实现了三种流感病毒H1N1的可视化检测。实时荧光定量PCR方法在新冠病毒检测等多种病毒检测中应用广泛,是检测的金标准,陈峥嵘[12]利用等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)核酸试纸条区分犬瘟热病毒(CDV)野毒株和疫苗株,通过双抗夹心法进行临床验证,发现该方法与实时荧光定量PCR相比较,更为简单快速。新冠肺炎确诊过程中,咽拭子的分子检测是用于确认新冠病毒感染的金标准,但该技术的检测结果假阴性率较高。Wen等[13]提出将新冠病毒核衣壳蛋白固定到一种固相LFIA条带(LFIAs)表面,并将抗人lgG与胶体金颗粒偶联。通过比较两种结果,该测定结果更准确且更快速。对分子测定的不完善诊断策略进行补充,可应用于新冠肺炎患者的大量分子筛查中。

2.2 纳米金层析试纸条与细菌检测

现阶段,致病菌的检测主要依赖于细菌培养、血清学检测、涂片检测等,在进行核酸检测时,往往需要PCR技术结合后续检测手段,存在着检测时间长,操作复杂以及对操作人员和仪器要求高等问题,纳米金核酸试纸条改善了以上缺点。如陈诗胜[14]制备了PCR核酸免疫层析试纸条检测奶牛乳房炎四种致病菌,通过肉眼直接观察核酸扩增后的条带结果,解决了PCR扩增后检测产物的复杂化问题,检测灵敏度远远高于普通琼脂糖凝胶电泳检测的灵敏度,且特异性高,可适用范围更广。在前期核酸扩增方面,张力支等[15]利用核酸外切酶Ⅲ循环酶切策略实现了单链信号放大,同时结合纳米金试纸条完成检测,李盛杰等[16]利用多酶恒温核酸快速扩增技术(Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification,MIRA)结合纳米金试纸条对霍乱弧菌进行快速鉴定。以上方法相较于细菌培养、PCR、环介导恒温扩增等方法,操作流程更为简便,对环境要求更低。纳米金还可与其他物质相结合,以便于核酸试纸条的检验。如贾慧建等[17]经实验建立了一种新型核酸试纸条,此试纸条将链霉亲和素与纳米金结合,用来检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因,对于患者的检测更为快速、准确。与核酸检测相比较,免疫试纸条检测灵敏度较低。为提高灵敏度,Jia等[18]利用纳米颗粒的光热效应实现信号的放大技术,建立了一种用于大肠杆菌检测的光热免疫过滤试纸条,将灵敏度提高了十倍。并且该方法可通过替换抗体,扩展到其他病原体的检测,具有普适性。

3 纳米金层析试纸条应用于疾病快速检测

近年来,随着全球饮食结构的变化和重金属污染事件的发生日益增多,世界各地都受到了严重影响,同时威胁着人类的生活和健康。因此开展疾病的预防检测工作显得至关重要。为进一步提高疾病检测结果的灵敏度和工作效率,节省检测时间,叶钰滢[19]通过结合重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)扩增技术和核酸试纸条,在30 min内检测出日本血吸虫基因片段。王海波[20]在纳米金试纸条生物传感器的基础上,提出可视化检测Pd2+、肝癌单核苷酸多态性(SNP)位点和慢性乙肝病毒(HBN-DNA)的方法,并且分别利用孔板放大和HCR放大策略等提高了检测灵敏度。阿尔兹海默症(Alzheimer disease,AD)是威胁老年群体的重要疾病之一,Liu等[21]发现AD病人体内乙酰胆碱酯酶(AChE)水平显著降低,因此提供了一种罗丹明B修饰的纳米金颗粒双读数(比色法和荧光法)的方法,检测了AD小鼠脑脊液中AChE的含量,结果表明该方法较现有方法选择性更好,且对于微量物质的检测更为灵敏。

4 纳米金试纸条在食品安全检测方面的应用

食品安全要求无毒,无公害且符合应当有的营养物质含量,不会对食用者产生致病的危害,但某些食品添加物会损害人体健康。比如,为防止食品腐败变质,加工时会人为地在动物性食品中添加抗生素。常芮[22]在侧向层析试纸条(LFS)应用于检测食品中抗生素的基础上,将鸟嘌呤-胞嘧啶DNA链修饰到纳米金颗粒上,构建了新型纳米模拟酶的信号放大LFS,进一步提高了纳米金试纸条在检测抗生素含量的灵敏度。食品中微生物的生长也会影响食品质量,预富集、选择性富集、毒素检测等微生物传统方法存在检测速度慢,鉴定结果不清晰等缺点[23-25]。张云红等[26]以食品中金黄色葡萄球菌为靶标,构建了一种巯基、生物素修饰的双核酸适配体夹心模式的层析试纸条,完成了金黄色葡萄球菌的定性检测。最后,农药残留也是影响食品安全主要因素之一,Liu等[27]预先制备了抗啶虫脒的单克隆抗体,利用样品中的啶虫脒与检测线上偶联的啶虫脒竞争性结合检测液中单克隆抗体的方法区分阳性与阴性结果,建立了啶虫脒残留检测技术,并成功用于市售黄瓜和苹果农药残留的检测,理论检测限约为1 ng/mL。

5 纳米金试纸条在检测真菌毒素方面的应用

真菌毒素在谷物、水中等广泛存在,易造成粮食以及水污染,从而对人类身体健康造成极大危害。在检测领域,传统的化学鉴定方法(如薄层色谱TLC)检测复杂、准确性低,无法满足市场对于即时检测的要求,纳米金试纸条作为一种快速检测技术,在真菌毒素检测方面逐渐应用于市场。邹鹏[28]制备了球状和花状纳米金层析试纸条,并在多种杂质存在的粗制样品中可以快速地检测出谷物及中药材中三种毒素(玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和赭曲霉毒素A),相较于食品检测中马彤彤[29]将球状改良成花状纳米金颗粒,球状和花状纳米金都可定性检测玉米赤霉烯酮,避免了假阳性的出现,从而完成市场初步筛查。黄馨雨[30]研究的同类型纳米金免疫层析试纸条也可在杂物中定性的检测出伏马毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇。相比于邹鹏检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇,该方法灵敏度更高。张珊[31]采用纳米金粒子与核酸适配体偶联的方法制备出核酸适配体试纸条,来检测黄曲霉素B1,相较于商品化检测试剂盒,该方法成本更低、检测范围更广,为检测其他产品奠定了基础,可以实现工业化实时检测。Wu等[32]开发了红曲发酵食品中桔青霉素的快速金纳米颗粒免疫层析条方法,实验表明这种方法灵敏度高、检测快速,在检测食品中的桔青霉素(CTN)具有很大帮助。

6 总结与展望

相比于传统的核酸检测方式,纳米金层析试纸条技术是一种高灵敏度、高特异性、准确、有效、快速可视化的检测技术,但其应用与推广仍然不广泛。第一,传统的纳米金试纸条检测需要抗体和抗原特异性结合反应产生抗体-抗原-纳米金颗粒复合物,而研制免疫层析试纸条的重要一步是制备特异性高、亲和力强的单克隆抗体,需要经过复杂的杂交瘤实验和筛选过程,开发周期长且耗费大量的人力与物力,实验成功率低,再者抗体偶联金标的过程较为复杂,以上都成为免疫试纸条研发的瓶颈。为了解决以上问题,首先可以尝试基于适配体的核酸检测方法,其次纳米金核酸检测试纸条可以根据检测对象灵活设计核酸探针,可在生物公司订购,避开了制备抗体的限制,为试纸条检测的广泛应用提供了条件。

第二,目前大多数纳米金层析试纸条检测是基于实验室环境进行的研究,若要将此技术更广泛、更便携地应用于物质检测,仍需将其应用于临床环境中。第三,现今所研究的试纸条是对于单一检测对象的检测,如符娜[33]农田生产中,仍然无法同时检测侵染植物的多种病毒,陈淑丹等[34]提出对同一检测对象进行多项检测时,只能逐一浸染各种测试项目的试纸条的现象。由此在试纸条探索过程中,对于可同时检测更多种类的检测对象的多功能甚至万能试纸条需要我们进一步研究。第四,在定量检测方面,目前大多数试纸条只能利用显色方式来检测是否含有检测对象,如郑方媛等[35]建立了核酸试纸条检测与交叉引物等温扩增技术相结合的快速检测狐狸源性成分的方法时,只能鉴定狐狸源性成分是否存在,而对于在狐狸源性成分的定量检测方面还需进一步研究,故对于定量检测目的对象上的探索仍然有很长的路要走。