痰证的血清生物标记物研究*

黄凯悦,齐景馨,罗文谦,陈梅妹,甘慧娟

(福建中医药大学,福建 福州 350122)

中医学认为痰是机体气化功能失司致津液输布、排泄失常,积聚于体内形成的病理产物[1]。“百病皆由痰作祟”,痰致病范围广泛,症状变化多端,是重要的致病因素[2]。诸多医家从痰论治疑难杂症取得显著疗效,但目前有关痰证的客观化指标尚未完全阐明。代谢组学是一项高通量、高分辨率的分析技术,采用全面、系统、动态的方法预测内源性代谢物的变化水平[3],从整体上揭示机体的生理病理状态,其研究思路与中医的整体观相契合,为中医证候的客观化提供重要平台[4]。代谢组学技术普遍应用于中医药领域的研究,在探寻中医证候的生物标志物中起重要作用[5]。但受人体复杂性及代谢组学检测手段的限制,目前关于痰证的代谢物尚无统一定论。本研究收集痰证血清代谢组学研究的相关文献,整理、归纳痰证患者的血清差异代谢产物、组学方法等信息,并进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代谢通路富集分析,探索痰证潜在生物标志物,揭示痰的部分客观化指标,为临床治疗痰证提供新思路。

1 资料与方法

1.1 文献来源

以“痰”“痰证”“代谢组学”“代谢物”“血清”“患者”为主题词,检索中国知网、万方数据知识服务平台、中文科技期刊全文数据库中痰证患者血清代谢组学研究的相关文献,检索时间为建库至2023年4月30日。

1.2 文献纳入标准

①临床研究类文献;②有健康对照病例的文献。

1.3 文献排除标准

①综述类、理论探讨类文献;②动物、细胞实验类文献;③重复发表的文献;④数据不全的文献。

1.4 文献筛选

将检索获得的相关文献导入NoteExpress整合、去重。由参与研究的3名成员严格按照制定的纳入、排除标准对文献中摘要、关键词及全文内容进行筛选,并交叉核对,删除不符合要求的文献。

1.5 文献数据处理

提取的数据需完全遵循临床研究文献中的表达形式,保证原始数据的规范性和真实性[6]。将收集的疾病名、中医证型、组学方法、血清差异代谢产物、富集通路等信息录入Excel 2021中,建立痰证潜在生物标记物数据库,并进行分析。

2 结 果

2.1 文献筛选结果

共检索出179篇文献,其中中国知网41篇、万方数据知识服务平台108篇、中文科技期刊全文数据库30篇,经筛选后最终纳入32篇文献。见图1。

图1 文献筛选流程图

2.2 病种分布及特征

纳入的32篇文献均为原始临床研究类文献,经统计分析,发现1篇未涉及具体病种,其余31篇共涉及8个病种。见表1。

表1 病种分布特征

2.3 痰证的临床证型分布及特征

痰证患者共1 194例,健康人群906例,涉及11种痰证的临床证型。见表2。

表2 痰证临床证型的分布特征

2.4 痰证血清差异代谢产物分析

梳理1 194例痰证患者和906例健康人的血清样本,获得301个血清差异代谢物。以5篇文献同时出现为阈值,进行代谢物频次均值统计分析,获得24个痰证血清差异代谢物,见表3。

表3 痰证的主要血清代谢物

2.5 痰证差异性代谢通路分析

采用超几何检验对24个痰证血清代谢物进行KEGG代谢通路富集分析[39]得到12条差异性代谢通路与中医痰证的发生有关。具体包括:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,苯丙氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,组氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,乙醛酸盐和二羧酸盐代谢,丁酸代谢,谷胱甘肽代谢,糖酵解/糖异生,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,氨酰tRNA生物合成。富集到的12条差异代谢通路中有8条差异代谢通路受到显著扰动(影响值>0.1),分别为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(影响值=1.0),苯丙氨酸代谢(影响值=0.36),甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(影响值=0.25),组氨酸代谢(影响值=0.22),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(影响值=0.20),乙醛酸盐和二羧酸盐代谢(影响值=0.14),丁酸代谢(影响值=0.11),谷胱甘肽代谢(影响值=0.11)。见图2。

注：横坐标表示代谢通路扰动值,纵坐标表示差异性代谢通路名称;气泡颜色表示P值,P值越小,颜色越深;富集个数越多,气泡越大。

3 讨 论

《丹溪心法》云:“痰之一物,随气升降,无处不到。”即痰可随气机升降出入停留于身体不同部位,临床表现复杂[40]。中医学认为饮食水谷转化为水谷精微的过程依赖气机的正常运行,与现代新型代谢模型相契合,水谷精微即能量物质,饮食水谷转换为能量物质,再通过脾气转输精微布散全身,濡养五脏六腑。能量物质在体内发生氧化的过程是气机运行的生理学基础[41],若饮食摄入过度,机体能量失衡,痰、湿、浊、脂堆积于体内,阻碍气机运行。近年来,痰证与糖、脂代谢紊乱的关联性研究是中医药研究领域的热点。研究[42]表明,体重指数(body mass index,BMI)与胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)是痰证的危险因素,HOMA-IR、血脂、BMI等客观指标也可作为痰证诊断的参考指标[1],表明中医痰证与糖、脂代谢紊乱密切相关。

本研究发现痰证患者血清氨基酸代谢差异物中谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸属生糖氨基酸,主要通过机体代谢转化为葡萄糖和糖原;苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、酪氨酸属生酮氨基酸,主要通过代谢转化成乙酰辅酶A和乙酰醋酸[43],并在肝脏内产生酮体,若体内酮体过量,则会导致酮血症和酮症酸中毒[44]。研究[45-46]显示,胰岛素抵抗与亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸类代谢物密切相关。苯丙氨酸属芳香族氨基酸,经苯丙氨酸羟化酶的催化转换为酪氨酸,共同参与机体的糖、脂代谢[36]。体内苯丙氨酸羟化酶缺乏导致机体对饮食摄入的苯丙氨酸不耐受,影响苯丙氨酸代谢,形成高苯丙氨酸血症,出现不可逆转的智力障碍[47]。苯丙氨酸、酪氨酸在体内的含量已被证实与胰岛素抵抗、肥胖等糖、脂代谢异常的疾病有关。张雯艳等[48]采用低、中、高剂量苯丙氨酸干预C57BL/6J小鼠,发现低、中、高剂量的苯丙氨酸组血糖、血脂均升高,其中低剂量组酪氨酸浓度高于中、高剂量组,表明苯丙氨酸浓度升高可能使机体出现胰岛素抵抗、血糖异常、血脂异常等,与痰证的病理机制相一致,进一步说明痰贯穿机体糖、脂代谢全过程[49-50]。亮氨酸是一种支链氨基酸,又属生酮氨基酸,能够快速分解转化为葡萄糖,促进肌肉修复。研究[51]发现,支链氨基酸浓度升高与胰岛素抵抗、2型糖尿病患病风险密切相关,体内循环支链氨基酸水平升高,影响糖酵解和脂肪酸氧化,导致线粒体功能障碍,促使胰岛素抵抗的形成。王志永[38]利用代谢组学技术探究痰湿体质血清差异代谢物,发现亮氨酸的浓度显著升高,主要与痰湿质人群体内脂肪代谢异常有关。组氨酸作为肌肽的前体物质,可调节摄食行为和能量代谢,增强机体抗氧化功能。组氨酸代谢途径的主要调节酶为组氨酸解氨酶,过量的组氨酸可能通过肝脏和皮肤中的组氨酸解氨酶转化为反式尿苷酸[52]。研究[24]表明,组氨酸在组氨酸脱羧酶的作用下生成组胺,并存在于肥大细胞中,诱导胃黏膜细胞分泌胃蛋白酶原和胃酸,进而表现出多食、易饥等相关症状。丙氨酸是葡萄糖和氨基酸代谢产物之一,参与葡萄糖-丙氨酸循环,将肌肉中的氨以无毒的丙氨酸形式经血液循环输送至肝脏,在肝脏中丙氨酸转化成丙酮酸,再经糖异生途径转化为葡萄糖,为肌肉组织提供能量。丙氨酸的浓度与消耗的葡萄糖成正比,浓度越高消耗的葡萄糖越多,痰证患者血清中丙氨酸的浓度降低,葡萄糖的消耗随之减少,葡萄糖含量升高,肝内糖异生作用增强,肌肉组织中参与糖无氧酵解的丙酮酸增多。谷氨酸是大脑皮质及神经中枢的重要的神经递质,影响大脑认知功能。谷氨酸与血氨形成谷氨酰胺,能解除代谢过程中氨的毒副作用,起到护肝的效果。本研究发现,痰证患者血清中谷氨酸代谢紊乱,机体血液中氨的浓度异常,伴疲乏、精神不振等虚性症状的出现,这与中医痰证的病理因素相一致,痰、浊、脂等长期堆积于内,阻滞气机,血行不畅,久则实转虚[29]。乳酸是糖异生过程的主要原料及糖酵解过程的最终产物。机体细胞在缺氧或无氧的状态下加快糖酵解,血清中乳酸水平随之升高,导致高乳酸血症的形成。已有研究证实BMI、尿素氮、血酮体是高乳酸血症的独立危险因素,并与血糖、血脂异常等代谢紊乱性疾病相关[53]。李修阳等[54]发现多囊卵巢综合征痰湿证患者血清中的乳酸水平显著增加,体内糖异生过程受到抑制,出现胸闷、倦怠、四肢乏力等痰湿证的临床表现。

KEGG代谢通路富集分析显示有8条差异代谢通路受到显著扰动,表明这8条差异代谢通路与中医痰证的发生影响最显著。痰证对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代谢通路的影响值达到1.0,说明该代谢通路异常与痰证形成最相关。同时,组氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,苯丙氨酸代谢通路在本次纳入的11篇临床研究文献中被重复富集,说明这4条氨基酸相关代谢通路与痰证形成密切相关。

综上所述,苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、乳酸等代谢物可能是中医痰证潜在生物标记物。组氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,苯丙氨酸代谢等代谢通路异常是痰证形成的潜在关键机制。本研究整合现有的临床痰证患者血清代谢组学研究结果,进行数据挖掘和通路富集分析,寻找痰证的潜在生物标记物和关键机制,有效解决临床样本量不够多、疾病谱不够广、结论不一致、可信度等问题,为中医证候生物标记物的研究提供了新的思路和方法。