基于化学计量法和指纹图谱对生姜不同处理方法的成分差异研究

汪 杰，刘宇洁，张 静，左池靖，刘 艳，梁万徽，余卫东，黄子豪，彭 灿, 2, 3, 4, 5*，俞 浩, 6*

基于化学计量法和指纹图谱对生姜不同处理方法的成分差异研究

汪 杰1，刘宇洁1，张 静1，左池靖1，刘 艳1，梁万徽1，余卫东1，黄子豪1，彭 灿1, 2, 3, 4, 5*，俞 浩1, 6*

1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012 2. 省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 230012 3. 安徽省乡村振兴协同技术服务中心，安徽 合肥 230012 4. 安徽省现代中药产业共性技术研究中心，安徽 合肥 230012 5. 药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012 6. 亳州学院中药学院，安徽 亳州 236800

采用UPLC建立生姜在冷提、回流2种不同处理方法的指纹图谱，再利用化学计量学和灰度关联分析法对不同处理方法下的生姜进行成分差异研究，采用电子舌技术找寻与生姜风味相关的关键性成分。利用UPLC建立生姜不同处理方法的指纹图谱，筛选共有峰，以Orbitrap-Exploris质谱对共有峰成分进行鉴定，再运用SIMCA、SPSS等软件进行化学计量学分析，通过层次聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和灰度关联分析评价不同处理方法下生姜的成分差异。从生姜指纹图谱中识别出10个共有峰，各批次的相似度在0.972～1.000；Orbitrap-Exploris质谱共鉴定出9个共有峰成分；HCA和PCA的结果显示，冷提法和回流法处理的生姜可以各自聚类，OPLS-DA确证了6-姜酚、8-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚、1,4-去二氢-10-姜酚是不同处理方法下生姜差异性的关键性成分；灰度关联分析结果表明，冷提法处理生姜可以得到更多姜酚类，姜烯酚类成分；电子舌结果表明，处理方法对生姜的风味并无显著影响，而6-姜酚与生姜诸多味觉信息呈显著性相关。利用UPLC指纹图谱结合化学计量学可以评估生姜的质量和风味物质的含量，可有效区分冷提法和回流法处理的生姜并筛选出差异性成分，为生姜的处理方式的选择提供了可靠的方法，并且利用电子舌技术得出6-姜酚是生姜味觉信息变化的关键性成分。

生姜；指纹图谱；Orbitrap-Exploris质谱；化学计量学；6-姜酚；8-姜酚；8-姜二酮；10-姜酚；1,4-去二氢-8-姜酚；1,4-去二氢-10-姜酚

生姜为姜科植物姜Rosc.的新鲜根茎[1]，含有多种功能成分，包括姜酚、精油、脂肪油、树脂、戊聚糖、蛋白质、微量矿物质等[2]。作为常用的调味料之一，生姜中不具有挥发性的姜酚类成分，赋予了其独特的辛辣味，这类物质的含量对生姜制品的品质和风味具有影响[3-4]。同时，作为一种药食同源药材，生姜也是一种著名的中药，姜酚是其主要的药理活性成分，具有抗氧化和清除自由基、抗凝血和抗血栓形成、降血糖、调血脂和抗动脉硬化、抑菌和抗炎、镇静止吐、抗肿瘤和增强免疫等多种药理作用[5-9]。姜酚因其特有的疗效，应用前景较为广阔，不论是在食品领域，还是在中药领域，生姜在使用时都需进行处理，由于姜酚中的酚类物质的不稳定性[10]，不恰当的处理方式会造成生姜中的有效成分流失，故需要一种处理生姜的方法减少其成分的流失，而指纹图谱[11-13]正是寻找这种处理方法的关键。目前，对于生姜的指纹图谱的建立还停留在不同产地的维度，如宋叶等[14]、郭家刚等[15]采用不同的方法建立不同产地的生姜指纹图谱，虽然能够筛选出不同产地生姜的差异化合物，但是并未对其进行鉴定；针对生姜的处理方法，文献多见报道探究其挥发性成分[16-17]或者某一类成分[18-20]的区别，并未系统地对生姜不同处理方法造成生姜成分差异进行研究。目前，国内外研究对于生姜电子舌的研究还停留在生姜作为调味料的阶段[21-22]，更多的学者使用电子鼻技术去探究生姜挥发性成分和其风味之间的关系[23-24]，并未提及生姜中非挥发性成分对其风味的影响。

基于以上情况，本实验使用了2种方法对生姜的有效成分进行提取，并建立了生姜不同提取方式的UPLC的指纹图谱，结合相似度评价软件和化学计量学[25-27]比较2种不同提取方式的生姜的风味成分及含量差异，采用UPLC-Orbitrap质谱[28]联用技术对相关指标成分和其他共有化学成分进行鉴定，采用电子舌检测生姜的风味信息，用以评价不同提取方式之间质量差异情况，从而为保留生姜独特的风味和其作为药食同源中药的使用提供理论基础。

1 材料

1.1 仪器

Waters ACQITY Arc系统（美国Waters公司）、Orbitrap Exploris120质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（中国巩义市予华仪器有限公司）、台式高速离心机（中国常州市万丰仪器制造有限公司）、YL-060S型超声波清洗机（中国济南巴克超声波科技有限公司）、BT25S型十万分之一电子天平（中国北京赛多利斯仪器有限公司）、RZ-688D型榨汁机（合肥荣事达三洋电器股份有限公司）、TS-5000Z型味觉分析系统（日本INSENT公司）。

1.2 试剂与药物

甲醇（色谱纯，西格玛奥德里星上海有限公司，批号34860-4L-R）；乙腈（色谱纯，北京百灵威科技有限公司，批号134752）；甲酸（分析纯，上海润捷化学试剂有限公司）；三氟乙酸（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号L1803273）；6-姜酚对照品（中国食品药品鉴定研究所，批号111833-201806）；对照品8-姜酚（成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB180305）、10-姜酚（成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB 180311）；所有对照品质量分数均大于98%；浓盐酸（国药集团化学试剂有限公司，批号20180223）；氯化钾（KCl，天津致远化学试剂有限公司，批号20211001830）；氢氧化钾（KOH）（天津市大茂化学试剂厂，批号20181101）；酒石酸（西陇化工股份有限公司，批号210722）；实验所用生姜均采自云南省，经安徽中医药大学药学院杨青山副教授鉴定为姜Rose.的新鲜根茎，共9批生姜药材，具体信息见表1。

表1 生姜样品信息来源

2 方法与结果

2.1 生姜指纹图谱的建立及相关的指标成分的鉴定

2.1.1 对照品溶液的配制 分别精密称取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品各4.05、3.98、4.02 mg于20 mL量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容，制成6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚混合对照品溶液，过0.22 µm微孔滤膜，备用。

2.1.2 供试品溶液的配制 将样品生姜剥皮，冲洗干净，用捣蒜器将生姜处理成碎末。称取200 g生姜，平均分成2份，分别加入75%甲醇500 mL，称定质量。分别回流（50 ℃）30 min、冷提（以额定功率为50 W的榨汁机榨汁处理）30 min。放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液为供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 色谱柱为Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1mm，1.9mm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，洗脱梯度（0～3 min，95% A；3～3.01 min，95%～85% A；3.01～12 min，85%～80% A；12～67 min，80%～25% A；67～67.01 min，25%～95% A；67.01～70 min，95%～85% A）进样量为20mL，体积流量为0.25 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃。

2.1.4 质谱条件 离子源：热喷雾离子源（H-ESI）；扫描方式：正、负离子扫描；正、负离子电压：3.5 kV；鞘气压力：45 L/min，辅助气压力：15 L/min，吹扫气压力：2 L/min；离子传输管温度：320 ℃，离子源温度：360 ℃；扫描方式：Full MS/ddMS2，一级质谱扫描范围80～1 200，分辨率：60 000 Hz，碎裂能量：20、40、60eV；动态扣除时间：3 s；使用EASY-ICTM。

2.1.5 精密度试验 取生姜样品（S1），按照“2.1.2”项的方法配制供试品溶液，按照“2.1.3”项的液相色谱条件连续进样6次，以3号峰为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，4-姜烯酚、6-姜酮酚、6-姜酚、1,4-去二氢-6-姜酚、8-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚、1,4-去二氢-10-姜酚的相对峰面积的RSD分别为1.04%、1.99%、1.08%、2.80%、1.01%、1.72%、1.03%、2.33%、2.24%，均小于3%；相对保留时间的RSD分别为0.50%、0.09%、0.08%、0.40%、0.13%、0.11%、0.13%、0.13%、0.13%均小于1%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取生姜样品（S1），按照“2.1.2”项的方法平行配制6份供试品溶液，按照“2.1.3”项的液相色谱条件连续进样，以3号峰为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，4-姜烯酚、6-姜酮酚、6-姜酚、1,4-去二氢-6-姜酚、8-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚、1,4-去二氢-10-姜酚的相对峰面积的RSD分别为1.54%、1.93%、1.37%、0.88%、1.69%、2.87%、1.71%、1.46%、2.24%，均小于3%；相对保留时间的RSD分别为0.07%、0.10%、0.07%、0.03%、0.07%、0.05%、0.08%、0.05%、0.05%，均小于1%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取生姜样品（S1），按照“2.1.2”项的方法配制供试品溶液，按照“2.1.3”项的液相色谱条件连续进样测定，分别于配制后的0、2、4、8、16、24 h进样测定，以3号峰为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，4-姜烯酚、6-姜酮酚、6-姜酚、1,4-去二氢-6-姜酚、8-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚、1,4-去二氢-10-姜酚的相对峰面积的RSD分别为1.34%、1.70%、1.09%、2.85%、1.38%、2.60%、1.07%、2.14%、1.80%，均小于3%；相对保留时间的RSD分别为0.47%、0.04%、0.06%、0.02%、0.11%、0.10%、0.11%、0.12%、0.12%，均小于1%，表明生姜供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 指纹图谱的建立及相似度评价 取18批生姜的供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定并对数据进行整理记录，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”处理数据，以S1号样品色谱图为参照图谱，采用平均数法生成共有模式，设置时间窗宽度为0.1 s，之后对18批样品进行多点校正和Mark峰匹配，建立18批生姜不同处理方法的UPLC指纹图谱及对照图谱（图1），共标定10个共有峰，通过与对照品（图1-C）比对，指认出其中3个成分。由于3号峰具有较好的峰形且峰面积较为稳定，故以3号峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的平均RSD值均低于1.0%。相似度评价结果表明（表2），表明18批生姜药材整体质量稳定，18批生姜样品指纹图谱相似度在0.972～1.000，但不同方法处理的生姜样品在化学成分上存在一定的差异。

2.1.9 共有峰的指认与归属 应用优化过的UPLC-Orbitrap-Exploris条件对生姜样品进行检测鉴定，正、负离子模式下总离子流色谱图（TIC）见图2。通过化合物的色谱保留时间、MS2碎片信息和精确相对分子质量，结合相关文献数据、数据库及对照品的质谱信息，鉴定出9个共有峰成分，分别为4-姜烯酚、6-姜酮酚、6-姜酚、1,4-去二氢-6-姜酚、8-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚、1,4-去二氢-10-姜酚，具体结果见表3。其中化合物3、6、8与对照品进行了比对验证。

2.2 基于化学计量学筛选相关的潜在指标成分

以10个共有峰的峰面积为变量，采用SIMCA软件对不同处理方法的生姜样品进行 聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）分析，再将18批生姜样品的10个共有峰的峰面积导入SPSS软件进行PCA，旨在筛选出2种不同处理方法下的生姜的潜在指标成分。

3-6-姜酚；6-8-姜酚；8-10-姜酚。

2.2.1 HCA 当类间距大于60时，不同处理方法的生姜样品主要分为2类（图3），冷提处理的样品组（S1～S9）聚为一类，回流处理的样品（S10～S18）聚为另一类。通过HCA结果分析，发现生姜的活性成分和风味物质的含量会随着处理方法的改变而改变，但该类成分具体是如何变化的，还有待进一步研究。

2.2.2 PCA 从18批生姜样品的PCA得分图中，可知18批样品分为2类；从SPSS分析结果中提取得到3个主成分，并得到主成分初始特征值及累积方差贡献率为92.116%，说明3个主成分即可代表样品的信息。通过图4-B碎石图中折线的变化度，可知前3个成分的变化较大，表明18批生姜样本之间的活性成分的含量方面存在些许差异。根据表4和表5，计算各个样本的主成分得分，得到综合得分模型为＝0.690 4＋0.129 1＋0.101 7（为3个主成分的得分，系数为3个主成分的累积方差贡献率），综合得分结果及排名见表6。结果表明，冷提处理的方法由于回流方法，提示冷提的方法可以更好地将生姜中的有效成分提取并保留。

表2 不同处理方法生姜样品指纹图谱相似度评价结果

图2 生姜正(A)、负(B) 离子模式下UPLC-Orbitrap-Exploris的总离子流图（TIC）

2.2.3 OPLS-DA OPLS-DA模型解释能力参数R为0.985和R为0.937，预测能力参数Q为0.637，充分说明所建的OPLS-DA模型良好，预测能力强，具有统计学意义。OPLS-DA的分类结果与PCA结果一致，分析生成各个共有峰的投影变量权重值（very important person，VIP）（图5）。在分析模型中，以VIP值＞1认为该变量对样本分组有显著性贡献。通过分析，筛选得到6个贡献值较大的差异性成分，分别为6-姜酚、8-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚，1,4-去二氢-10-姜酚，可作为不同处理方法下的生姜质量评价的标志性成分。

表3 UPLC-Orbitrap-Exploris鉴定生姜的共有峰成分

图3 不同处理方法的生姜层次聚类分析图

2.3 基于灰色关联度模型评价不同处理方法下的生姜质量

灰色关联度分析法是一种根据事物的发展趋势来判定因素关联程度的一种分析方法[30]。根据其高度一致的关联分析和其趋势和走向一般不易偏离轨道，可以较为准确地去探究多指标、多靶点的规律性，解决药食同源药材中活性成分较多，多指标成分评价等较为困难的问题。

由于生姜各评价指标间的数据存在差异，则对生姜原始数据变量进行无量纲化中的均值法处理，公式为M＝N/N[30]，式中M为无量纲化处理后的数据，N为原始数据，N为第个样品第个指标的均值，其中＝1，2，3……，=18；＝1，2，3……，＝10。采用指纹图谱峰面积作为指标进行灰色关联度分析，以18批不同处理方法的生姜样品作为评价项，选择各指标峰面积的最大值为最优参考序列，最小值为最差参考序列，采用SPSSPRO在线分析网站以指纹图谱峰面积为评价指标，计算各评价指标相对于最优、最差参考序列的关联度和关联系数，并计算各评价指标的相对关联度，之后以最优参考序列为母序列，计算生姜样品间相对关联度，最后通过相对关联度大小对评价项进行排序，得到优劣评价结果，见表7。结果表明，不同处理方法下生姜相对关联度为0.441～0.550，质量排名前3的样品分别是S13（冷提法）、S12（冷提法）、S10（冷提法），冷提处理的和回流法处理的生姜样品相对关联度平均值分别为0.456、0.534，结果表明，冷提处理可以保留生姜更多的活性成分，而回流处理可能由于温度升高的原因，导致部分有效物质流失，影响生姜的使用。

图4 PCA得分图 (A) 和主成分碎石图(B)

表4 主成分矩阵

表5 主成分特征值及方差贡献率

表6 生姜样本的主成分得分及排名

图5 OPLS-DA得分图(A) 和VIP值(B)

表7 不同处理方法的生姜样品相对关联度及质量优劣排序结果

2.4 基于电子舌技术的生姜风味研究

2.4.1 样品前处理 将样品生姜剥皮，冲洗干净，用捣蒜器将生姜处理成碎末。称取30 g生姜，平均分成2份，分别加入75%的甲醇50 mL，称定质量。分别水浴回流（50 ℃）30 min、冷提（额定功率50 W）30 min。放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，离心15 min（3 500 r/min）后取上清液5 mL，加100 mL纯净水搅拌均匀，进行测试。

2.4.2 测试用液 Reference溶液（基准液）：30 mmol/L的KCl溶液和0.3 mmol/L酒石酸（基准液：用于传感器保存液、稳定液、洗涤液。也是味觉传感器的预处理溶液）；负极清洗液：100 mmol/L盐酸＋30%体积乙醇；正极清洗液：10 mmol/L氢氧化钾＋100 mmol/L氯化钾＋30%体积乙醇（正负极清洗液：用于对传感器的清洗）。

2.4.3 电子舌测试及结果 采用电子舌技术对不同处理方法下的生姜味觉进行测定，收集测试数据，结果见图6-A。通过雷达图及SPSS独立检验分析，发现冷提和回流处理的生姜的风味并无显著性差异。

2.4.4 不同处理方法下的生姜标志性成分和味觉成分的相关性分析 为了了解不同处理方法下生姜的生姜标志性成分和味觉成分之间的关联，将将生姜中6个标志性成分与生姜味觉传感器测定值进行皮尔逊（Pearson）相关性分析。结果表明（图6-B），6-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚、1,4-去二氢-10-姜酚与酸味存在显著的正相关性；6-姜酚与酸味、涩味、苦味、苦味回味、涩味回味存在显著的正相关性，与鲜味、丰富性、甜味存在显著的负相关性。

*P＜0.05；*P＜0.01。

3 讨论

本实验采用UPLC指纹图谱结合化学计量学和电子舌技术对生姜质量和风味进行评价，并应用Orbitrap-Exploris对质量标志物进行鉴定，分别为6-姜酚、8-姜酚、8-姜二酮、10-姜酚、1,4-去二氢-8-姜酚、1,4-去二氢-10-姜酚，提示该模式可快速、全面评定不同处理方法对生姜活性成分保留的能力以及中药质量的优良性和稳定性。UPLC指纹图谱结合化学计量学和电子舌技术为生姜的加工方法筛选提供标志性成分，灰色关联度分析结果对生姜加工方式的选择提供研究基础。其中，6-姜酚既是生姜不同处理方法的指标成分，又是生姜味道变化的关键性物质，其还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和调节脂质代谢的作用[31-32]，提示6-姜酚可作为生姜在治疗疾病的过程中的首要成分。后续还将进行生姜的气相色谱分析，旨在全面地了解影响不同处理方法对生姜的活性成分的影响，为生姜作为中药的质量标准评价建立基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Compositional differences of different treatments ofbased on chemometric and fingerprinting methods

WANG Jie1, LIU Yujie1, ZHANG Jing1, ZUO Chijing1, LIU Yan1, LIANG Wanhui1, YU Weidong1, HUANG Zihao1, PENG Can1, 2, 3, 4, 5, YU Hao1, 6

1. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 2. MOE-Anhui Joint Collaborative Innovation Center for Quality Improvement of Anhui Genuine Chinese Medicinal Materials, Hefei 230012, China 3. Anhui Province Rural Revitalization Collaborative Technology Service Center, Hefei 230012, China 4. Anhui Province Modern Chinese Medicine Industry Common Technology Research Center, Hefei 230012, China 5. Anhui Province Key Laboratory of Pharmaceutical Preparation Technology and Application, Hefei 230012, China 6. College of Traditional Chinese Medicine, Bozhou University, Bozhou 236800, China

UPLC was used to establish the fingerprints of Jiang (Rosc.) in two different treatments of cold extraction and reflux, and then chemometrics and gray correlation analysis were used to investigate the differences in the composition ofunder different treatments.The fingerprints of different treatments ofwere established by UPLC, the common peaks were screened, the common peak components were identified by Orbitrap-Exploris mass spectrometry, and then chemometric analysis was performed by SIMCA and SPSS. Hierarchical Clustering Analysis (HCA), Principal Component Analysis (PCA), Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis (OPLS-DA) and Grayscale Correlation Analysis were used to evaluate the compositional differences ofunder different treatment methods.Ten shared peaks were identified from thefingerprint profile, with similarities between 0.972 and 1.000 for each batch. Nine shared peak components were identified by Orbitrap-Exploris mass spectrometry. The results of HCA and PCA showed thattreated by cold extraction and reflux methods could be clustered individually, and OPLS-DA confirmed that 6-gingerol, 6-gingerenol, 8-gingerdione, 8-gingerol, 1,4-desdihydro-8-gingerol, and 1,4-desdihydro-10-gingerol were the key components for the variability ofunder different treatments. The results of the gray-scale correlation analysis showed that the treatment ofby cold extraction method could yield more curcumin, gingerolenic components.UPLC fingerprinting combined with chemometrics can assess the quality and flavor content of, which can effectively distinguish betweentreated by cold extraction and reflux methods and screen out the differential components, providing a reliable method for the selection oftreatment.

Rosc.; fingerprint; Orbitrap-Exploris mass spectrometry; chemometrics; 6-gingerol; 8-gingerol; 8-gingerdione; 10-gingerol; 1,4-desdihydro-8-gingerol; 1,4-desdihydro-10-gingerol

R286.2

A

0253 - 2670(2024)09 - 3107 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.024

2023-10-01

安徽省科技重大专项（202103a07020001）；安徽省高校协同创新项目（GXXT-2022-084，GXXT-2022-075，GXXT-2020-025）

汪 杰（1999—），男，硕士研究生，研究方向为中药质量控制。E-mail: 1918283102@qq.com

通信作者：彭 灿（1984—），男，教授，博士，研究方向为药物制剂新技术与药物体内外分析。E-mail: pengcanking@hotmail.com

俞 浩（1975—），男，教授，博士，研究方向为中药资源开发与利用。E-mail: yhz_1230@163.com

[责任编辑 时圣明]