8种蜀葵花型花粉形态1)

陈曦 李意峰 刘才磊 贾茵 潘远智 姜贝贝 李秀 朱章顺 李方文 刘晓莉

(成都市植物园,成都,610083) (四川农业大学) (成都市植物园)

蜀葵(Alcearosea)为锦葵科(Malvaceae)蜀葵属(Alcea)多年生直立草本[1],原产于我国四川地区,又名棋盘花、一丈红、饼子花等,其观赏价值极高,在世界各地广泛栽植。由于蜀葵属于兼性异交型植物[2],极易杂交,因此表现出丰富多彩的表型变异,如株型上可分为高杆型和矮生型;花色有白、黄、粉、橙、红、紫、黑等色系;花型有单瓣型、复瓣型、疏球型、密球型、托桂型、玉蕊型、皇冠型、绣球型等[3]。丰富的表型变异也使得蜀葵不同品种之间亲缘关系不明,品种分类模糊不清,不利于对其进一步开发利用。

目前,蜀葵的研究主要集中在非生物胁迫[4-6]、化学成分提取[7-9]等方面,而蜀葵花粉形态的相关研究未见报道。植物的花粉形态特征受外界环境影响较小,主要由基因控制,并且有着很强的遗传保守性和稳定性[10]。彭焕文等[11]对锦葵科15个属下26个分类群体的花粉形态进行研究,认为花粉形态及外壁形貌特征等对锦葵科不同物种的划分有很大的分类学意义。近年来,对同一种内不同品种间的花粉形态差异也开展了一系列研究,如锦葵科的木芙蓉(Hibiscusmutabilis)[12]与木槿(H.syriacus)[13]等,结果发现,不同品种间花粉形态也具有一定的差异,可以作为品种划分以及品种间亲缘关系研究的重要依据。

为了探究蜀葵不同花型间的差异及其亲缘关系,本试验以8种花型的蜀葵花粉为研究对象,利用扫描电镜对花粉形态特征及表面纹饰进行观测,探究其孢粉差异,通过聚类分析和主成分分析探讨蜀葵不同花型种质间的亲缘关系,旨在为蜀葵花型多样性研究及亲缘关系研究提供孢粉学依据。

1 材料与方法

植物材料:以栽植于成都市植物园(104°8′11.274″E,30°46′13.573″N)8种花型的粉紫色(RHS2019 75B Light Purple)矮生型蜀葵为供试材料,8种花型分别为单瓣型(S)、星火型(L)、复瓣型(D)、疏球型(B)、火炬型(F)、托桂型(T)、锦蕊型(X)、玉蕊型(Y,图1)。

S为单瓣型;D为复瓣型;B为疏球型;L为星火型;F为火炬型;T为托桂型;X为锦蕊型;Y为玉蕊型。图1 8种蜀葵花型

花粉采集和处理:参考张璐等[12]的方法,2022年6月在蜀葵盛花期选取健康植株中部花朵,用剪刀取下完整雄蕊柱,从雄蕊柱上剥离花粉囊后混合均匀,硫酸纸包裹后在烘箱中60 ℃烘干24 h,收集自然散粉,保存于离心管中备用待测。

电镜制样及花粉形态观察:用授粉笔蘸取适量干燥后的花粉轻刷于导电胶上,真空喷金镀膜30 s,在ZEISS Gemini 300型扫描电子显微镜下选取有代表性的视野,观察花粉粒形态和外壁纹饰特征,选取放大200倍视野拍摄花粉粒的直径,选取放大1 400倍视野拍摄单个花粉粒的外壁纹饰特征,分别选取5 000倍和15 000倍放大倍数拍摄花粉细节及刺的形态。参考彭焕文等[11]、刘金兰等[14]对锦葵科植物花粉的观测方法,花粉形态术语参考Christensen[15]、王开发等[16]研究进行描述。每个样品随机选取20粒花粉,对蜀葵花粉粒的直径、刺长、刺基宽、刺数量(单面)、突起数量(单面)等指标进行测量。

数据处理:试验数据用Excel 2016软件制表,使用SPSS 26软件进行差异显著性分析(P<0.05),SPSS 26对数据进行主成分分析、R型聚类分析和Q型聚类分析。

2 结果与分析

2.1 花粉形态及纹饰特征

花粉特征和大小:由图2、图3和表1可知,8种花型的蜀葵花粉粒均为单粒近球形。不同花型的花粉(不含刺)直径为102.93～114.20 μm,平均为110.52 μm,变异系数为3.40%,属于很大型花粉粒。其中,火炬型花粉直径最大,为114.20 μm,疏球型最小,为102.93 μm,变异系数分别为2.75%、4.61%。

表1 蜀葵花粉形貌特征

S为单瓣型;D为复瓣型;B为疏球型;L为星火型;F为火炬型;T为托桂型;X为锦蕊型;Y为玉蕊型。图2 蜀葵花粉群体形态

外壁纹饰:蜀葵8种花型花粉外壁均有刺状纹饰(图4、图5),具体表现为二型刺,其突起(第二型刺)明显短于第一型刺,形似瘤状突起,先端圆滑。测量其第一型刺的长度,8种花型的刺长为8.11～10.30 μm,平均为9.39 μm,变异系数为6.94%。复瓣型的刺最长,为10.30 μm,托桂型的刺最短,为8.11 μm,变异系数分别为16.55%、10.19%。刺基宽为4.01～4.80 μm,平均为4.32 μm,变异系数为5.97%。其中,单瓣型最宽,为4.80 μm,锦蕊型最窄,为4.01 μm,变异系数分别为16.06%、16.20%。刺间距为12.96～16.33 μm,平均值为14.96 μm,变异系数为6.47%。其中,复瓣型的刺间距最大,为16.33 μm,疏球型的刺间距最小,为12.96 μm,变异系数分别为11.95%、16.40%。锦蕊型和玉蕊型的刺长、刺基宽比最大,为2.39,说明刺状纹饰表现为细长型;托桂型的刺长、刺基宽比最小,为1.82,说明刺状纹饰表现为粗短型。刺的数量(单面)为88.50～103.75枚,平均为96.69枚,变异系数为4.85%。其中,疏球型的刺数量最多,为103.75枚,复瓣型的刺数量最少,为88.50枚。突起数量(单面)为140.75～200.75枚,平均为170.95枚,变异系数为11.54%。其中,托桂型最多,为200.75枚,疏球型的最少,为140.75枚。

S为单瓣型;D为复瓣型;B为疏球型;L为星火型;F为火炬型;T为托桂型;X为锦蕊型;Y为玉蕊型。图4 蜀葵花粉外壁纹饰形态

S为单瓣型;D为复瓣型;B为疏球型;L为星火型;F为火炬型;T为托桂型;X为锦蕊型;Y为玉蕊型。图5 蜀葵花粉刺部形态

萌发孔:蜀葵花粉具有大量散孔,孔呈圆形,密布于整个花粉表面。复瓣型、疏球型具有十分明显的萌发孔(图6),且单面观测到的萌发孔在140枚左右;玉蕊型在众多花粉粒中仅观察到一粒含有157枚萌发孔的花粉粒;单瓣型、星火型、火炬型、托桂型、锦蕊型等并未发现有明显的萌发孔,但星火型、锦蕊型在萌发孔位置处发现一些轻微的坑状形态,推测可能是由于萌发孔被某些物质堵塞,所以观察不到。

S为单瓣型;D为复瓣型;B为疏球型;L为星火型;F为火炬型;T为托桂型;X为锦蕊型;Y为玉蕊型。图6 蜀葵花粉萌发孔形态

2.2 蜀葵花粉形貌特征聚类分析

为分析所选指标之间的相关性,先进行R型聚类分析,选取代表性强的指标进行下一步分析[14]。由蜀葵花粉形貌特征R型聚类分析图(图7)可知,刺长和刺长刺基宽比、刺基宽和突起数量、直径和刺间距相关性较大,整体所选取的各性状指标较为分散,说明选取指标较为合理。此外,为确保所选指标的有效性与相关性,对花粉直径、刺长、刺基宽、刺间距、刺数量、突起数量、刺长刺基宽比7个指标进行主成分分析。由表2、3结果可知,2个主成分可以包含蜀葵花粉形态的大部分信息,累计贡献率为82.37%,且各主成分所含指标具有代表性。其中,第一主成分主要包括突起数量、刺长刺基宽比、刺基宽、刺长、花粉直径;第二主成分为刺数量、刺间距。虽然R型聚类发现刺长和刺长刺基宽比、刺基宽和突起数量、直径和刺间距等指标相关性较强,但在主成分分析中发现它们都具有很强的贡献率,故都予以保留,综合R型聚类分析和主成分分析结果用于下一步Q型聚类分析。

表2 蜀葵花粉形貌特征主成分分析得分

表3 蜀葵花粉形貌特征主成分分析结果

以花粉直径、刺长、刺基宽、刺间距、刺数量、突起数量、刺长刺基宽比为指标,对蜀葵的8种花型采用瓦尔德法进行Q型聚类分析。结果(图8)表明,当遗传距离为15时,8个花型可分为3大类,类型Ⅰ包含星火型、玉蕊型、锦蕊型、复瓣型4种花型,该类型突起数量中等(155～180枚)、刺表现为细长(刺长、刺基宽比≥2.29)的特征;类型Ⅱ仅有疏球型1种花型,该类型表现为花粉粒直径最小(直径<103 μm)、刺间距最小(刺间距<13 μm)、刺数量最多(刺数量>103枚)、突起数量最少(突起数量<141枚)等特征;类型Ⅲ有单瓣型、火炬型、托桂型3种花型,该类型突起数量最多(突起数量>182枚)、刺长最短(刺长<9.20 μm)、刺基部最宽(刺基宽>4.40 μm),刺表现为短而粗(刺长、刺基宽比≤2.01)的特征。

图8 蜀葵花粉形貌特征Q型聚类分析结果

3 讨论与结论

花粉形态及表面纹饰具有特异性,且包含有大量信息,这些特征主要受基因控制,因此,遗传稳定性和保守性较强[17]。目前,已有龙胆科(Gentianaceae)[10]、蔷薇属(Rosa)[18]、杜鹃属(Rhododendron)[19]、葡萄属(Vitis)[20]等许多植物利用花粉形态进行种属间分类和亲缘关系分析的相关研究。还有研究表明,植物花粉形态及表面纹饰不仅在种属上具有差异,在种下品种分类中也起到了关键作用,如木芙蓉[12]、木槿[13]、小苍兰(Freesiarefracta)[21]、玉兰(Yulaniadenudata)[22]等植物利用品种间的花粉形态差异进行了分类和亲缘关系研究。

据研究,锦葵科植物花粉进化方向为花粉表面刺由短到长,由钝至尖[11-12]。本研究中,第Ⅲ类包含单瓣型、火炬型和托桂型3种花型,刺长、刺基宽比最小(刺长、刺基宽比≤2.01),说明刺表现为短粗的特征,推断这3种花型亲缘关系更近,且属于较为原始的花型,也印证了重瓣花是由单瓣花演变而来的结论。类型Ⅰ中,锦蕊型和玉蕊型的刺长、刺基宽比(2.39)最大,说明它们的刺最为细长,可能是8种花型中最进化的类群,这两种花型的雌蕊都发生了瓣化,表型亦反映出其属于更为进化的花型。通过Q型聚类分析图可见,当遗传距离为15时,疏球型单独聚为一类,该花型的雄蕊大量退化,只在花瓣中夹杂少量花粉,由图2B可见,许多花粉粒干瘪且刺凌乱,这种现象应该与雄蕊大部分退化导致花粉形态受损有关,因此,孢粉与花的表型表现一致。

本研究中,蜀葵花粉粒的萌发孔数量(单面)为139～157枚,但花粉粒直径、刺长同彭焕文等[11]观测到的数据有一定出入,原因是其采用鲜活花粉粒直接喷金镀膜后进行观测,鲜活花粉粒会比干燥脱水后的更加膨大。本试验发现,有些花型的蜀葵花粉萌发孔不明显,呈现轻微的坑状,这种现象不仅出现在不同花型中,还出现在同种花型的不同花粉粒之间,该现象也在木芙蓉的研究中被发现,据研究,木芙蓉一些品种的萌发孔含有孔盖[12],另外,萌发孔会分泌一些物质将孔堵塞。萌发孔可以分为简单孔和复杂孔,复杂孔外壁两层在孔处分离形成孔室,蜀葵部分花型的萌发孔不易被观察到,是否由于含有孔盖,或者因不同花粉粒所处发育时期不同而分泌的物质将孔室堵塞还有待进一步探讨。

已有研究表明,花粉外壁包含柱状层和覆盖层,二者排列方式和加厚程度不同,导致了花粉外表各种纹饰的差异[16]。透射电子显微镜(TEM)可以观察花粉内部结构及花粉外壁层次构造,孙京田等[23]利用透射电镜对蜀葵等7种锦葵科植物花粉壁进行观察,结果表明,不同种之间花粉内外壁厚度等存在显著差异,蜀葵花粉外壁厚约为7.36 μm,蜀葵的刺状纹饰由覆盖层加厚形成,柱状层基本不参与刺的形成。因此,在后续的研究中可以利用透射电镜对蜀葵花粉壁超微结构进行观测,结合扫描电镜观测孢粉表面形态,更加深入地探讨不同花型间的孢粉差异。此外,张良英等[24]利用扫描电镜对悬钩子属(Rubus)野生种及栽培品种进行花粉形态观察,发现二者外壁纹饰存在差异,且野生种的外壁纹饰更加丰富。为了更好探究蜀葵花型之间的亲缘关系,后续研究中可以对野生蜀葵展开孢粉学研究,这对于探讨蜀葵花型间的亲缘关系及演化进程十分重要。

本研究通过对蜀葵8种不同花型的花粉形态进行观测发现,蜀葵8种花型花粉直径平均为110.52 μm,刺长平均为9.39 μm,刺基宽平均为4.32 μm,刺数量(单面)平均为96.69枚,突起数量(单面)平均为170.95枚。通过聚类分析发现,8种花型可以分为3大类,类型Ⅰ包含星火型、玉蕊型、锦蕊型和复瓣型;类型Ⅱ仅疏球型;类型Ⅲ含单瓣型、火炬型和托桂型。这为今后蜀葵花型鉴定以及品种分类提供了孢粉学依据,在蜀葵新品种的培育及蜀葵资源的开发利用等方面具有重要意义。