肺泡类器官在慢性阻塞性肺疾病中的应用及研究进展

樊霏霏 杨明夏

肺是一个复杂的器官,由高度分支的气道和肺泡两部分组成,参与重要的生理过程,其细胞及组织的复杂性保证了肺的免疫防御和气体交换功能[1]。肺泡主要由肺泡Ⅰ型上皮细胞(alveolar type Ⅰ cells,ATⅠ)和肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ cells,ATⅡ)构成。ATⅠ参与构成气-血屏障,ATⅡ的主要功能是分泌表面活性物质,降低肺泡表面张力,以维持肺泡的正常形态[2]。肺的发育过程十分复杂,任何阶段的发育失败或缺陷都可能导致疾病甚至死亡[3]。在肺发育成熟后,内环境稳定时,细胞的更新率很低,呼吸道祖细胞处于静止状态,在面对各种损伤性刺激时祖细胞可增殖分化以应对环境的变化[4],这种能力引起了研究者的关注,为肺部疾病的研究及治疗提供了新思路。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以持续存在的气流受限为特征的慢性疾病,可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭,气流受限呈进行性发展[5],与气道对有毒颗粒或气体的炎性反应增强有关[6]。慢阻肺的致残率和病死率逐年上升,根据2022年的慢性阻塞性肺疾病全球倡议指南,慢阻肺是目前全球三大死亡原因之一,是未来慢性病的主要经济负担[7]。慢阻肺具有进行性、不可逆的特征,患者长期咳嗽、喘息,可逐渐演变为肺心病,最后累及全身各个系统[8]。临床上的治疗方法主要包括非药物治疗、药物治疗、氧疗等来改善患者的生活质量[9]。然而,这些治疗方式并不能解决根本问题,肺泡类器官的出现为慢阻肺的精准治疗提供了新思路。本文对肺泡类器官近年来的发展及其在慢阻肺相关研究中的应用进行总结,为今后的研究提供理论依据。

一、类器官

类器官来源于干细胞,是指细胞在体外通过3D培养生长形成的高度模拟体内生理病理状态的组织培养物,可分化为特定的器官结构[10]。以胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和组织特异性干细胞在特定三维空间中构建出的类器官最常被用于体外的研究[11]。目前已经有包括肝脏、肾脏、乳腺、前列腺和肿瘤等多种人体组织和器官成功构建了类器官[12-14],这些类器官具有与原始器官相似的组织结构和生理功能,近年来逐渐用于疾病建模[15]、再生医学[16]和发育过程[17]的研究,也可以作为药物筛选[18]的工具,并为不可逆病变或损伤的替代治疗[19]提供了可能。

二、肺泡类器官的构建及优越性

人类肺脏由气管、支气管和细支气管构成气道,进行气体交换的肺泡由Ⅰ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞以及血管系统构成。肺泡类器官培养的基础源自于Ⅱ型肺泡上皮细胞具有多能干细胞特性[20]。在慢阻肺的发展过程中,肺泡结构会发生不同程度的病变,ATⅡ能增殖、分化修复受损的ATⅠ,维持肺泡上皮细胞正常结构和功能[21]。肺泡类器官是指肺干细胞在3D培养下形成的类似于肺泡结构的组织培养物,表达肺泡上皮细胞标志物并包含部分肺间充质细胞[22]。目前肺泡类器官已应用于多种肺泡病变的疾病并取得研究进展[23-25]。肺泡类器官培养体系除了包含具有干细胞特性的Ⅱ型肺泡上皮细胞,还需要添加其他共培养的细胞及细胞因子。目前肺泡类器官的培养常在DMEM/F12等基础培养基中添加有利于干细胞增殖分化的细胞因子如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等[26],研究者需要根据培养目的确定细胞因子的种类和用量。此外,类器官3D结构的形成严重依赖于细胞外基质,目前最为广泛使用的是基质胶,这种基质通常化学成分定义不清,并且可调性和可重复性有限[27],近期发现的一种基质透明质酸水凝胶,其物理和生化性质可精确调整,并且可以有效改善肺泡类器官的不均一性[28],为肺泡类器官发育成熟提供了更多的可能。近期有文献报道运用支架材料有望解决肺类器官结构大小不一的问题[29],进一步完善类器官的培养体系是亟待解决的问题。

在进行疾病研究时,研究者以往常常通过体外培养细胞并施加一定的刺激或构建动物模型模拟人体来展开研究,但体外培养环境和人体内环境存在差异,且不能准确反应各因素在组织和器官水平上对疾病的影响。构建动物疾病模型可以在一定程度上模拟疾病作用于人体的症状和机制,但动物与人的器官结构上存在差异[30]。构建类器官疾病模型可以弥补上述不足,来源细胞可通过多种方式从人体分离获取,如AT2细胞可以通过流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)或磁珠分选技术(magnetic bead sorting,MACS)经过单克隆抗体HTII280进行分离[31],可快速高效培养出大量的类器官疾病模型。与构建完整的肺部类器官相比,肺泡类器官肺泡的结构更为精细,更加适用于慢阻肺、肺纤维化等肺泡病变的肺部疾病,且在特异性药物筛选方面具有优势。肺泡类器官帮助我们进一步了解人体肺泡结构及发育过程中的变化,而肺泡重建是我们研究肺再生中的重要一步,研究各个危险因素作用于肺泡造成的损伤有助于我们发现疾病治疗的潜在靶点,因此,肺泡类器官作为新型疾病模型在肺泡病变的疾病研究中具有优越性。

三、肺泡类器官在慢阻肺相关机制研究中的应用

慢性阻塞性肺疾病的特征是慢性气道炎症、气道重塑以及肺泡组织的损伤,即肺气肿[32]。慢阻肺的发生发展与各种遗传因素和环境因素有关,吸烟是最主要的危险因素之一[33]。长期暴露于香烟烟雾(cigarette smoke,CS)会导致肺出现慢性炎症、氧化应激失衡和上皮细胞受损,肺不能修复这些损伤,从而导致肺气肿,受损的肺组织修复,特别是受损的肺泡上皮细胞修复过程进一步促进了肺气肿的发展和进展[34],但其机制尚不清楚。

研究者常用香烟烟雾以及香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激构建慢阻肺疾病模型。已有研究证实,COPD患者发生肺气肿时肺上皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路表达受到抑制[35],一项研究使用GSK-3β抑制剂氯化锂激活Wnt/β-catenin信号通路,可使肺气肿逆转[36],更为重要的是,该抑制剂可使COPD患者来源的肺泡类器官中的肺泡上皮细胞激活[37]。另一项研究在体外3D原代培养AT2细胞并构建肺泡类器官,研究香烟烟雾对WNT信号下游的特异性受体卷曲蛋白-4(FZD4)、Wnt/β-catenin信号通路和肺弹性成分的影响,通过上调和下调FZD4的表达研究FZD4的表达对肺泡上皮细胞伤口愈合、修复及弹性成分表达的影响,该研究显示香烟烟雾可下调FZD4,从而降低Wnt/β-catenin信号通路的表达,阻止COPD中的肺泡组织修复[38]。这些数据表明,通过靶向作用于肺组织中的Wnt受体促进Wnt信号通路的表达,可能会改善肺泡上皮细胞功能,从而为COPD患者的组织修复提供了一种潜在的方法。NgBlichfeldt等[39]人的研究发现慢阻肺疾病患者WNT5A、WNT5B表达增加、FZD4表达降低与肺间质成纤维细胞分化为肌成纤维细胞有关,肌成纤维细胞不仅能抑制Wnt信号通路,还能下调HGF、FGF7的表达,两者协同进一步加重上皮损害。因此,一些研究者将治疗靶点聚焦于激活Wnt信号通路。一项研究合成非选择性Rho卷曲螺旋形成相关蛋白激酶抑制剂,发现能有效逆转上述情况,促进肺泡类器官的形成[40]。目前还没有针对慢阻肺发病机制的治疗方法,因此发现新的治疗靶点对诱导慢阻肺患者肺损伤修复十分重要,肺泡类器官的发展为相关研究提供了新平台。

一项研究将小鼠长期暴露于CS构建慢阻肺模型,分离细胞培养肺泡类器官来探索序列相似成员13A家族(family with sequence similarity 13 member A,FAM13A)基因的表达对慢阻肺的作用。结果显示暴露于香烟烟雾时FAM13A表达缺失,AT2细胞中WNT通路激活,相比于FAM13A表达增加的小鼠肺细胞发育出更多肺泡类器官[41]。Lin等[42]通过体外 培养小鼠原代AT2细胞构建肺泡类器官,并给予不同浓度CSE刺激,发现在达到毒性浓度之前,增加CSE的浓度可促进ATⅡ增殖分化,并抵抗凋亡,促进类器官的形成。空气污染是慢阻肺的重要危险因素,一些研究者构建肺泡类器官并引入污染气体研究其对肺泡的损伤机制。一项研究在肺泡类器官的培养基中加入PM2.5引起肺泡损伤,研究发现AT2增殖能力增强但修复能力受损,且ATⅠ与ATⅡ细胞数量的比值明显下降,结果表明抑制了ATⅡ细胞转分化[43]。使用柴油废气处理肺泡类器官2周,发现类器官明显减少,并与Wnt信号通路抑制有关[44]。随着慢阻肺病情进展,患者肺泡上皮细胞的修复功能进行性损伤促进了肺气肿的发生发展,利用肺泡类器官研究肺泡上皮细胞的发生发展及转分化机制为肺再生的进一步发展带来了希望。

四、慢阻肺治疗药物的筛选

药物治疗是慢阻肺治疗中极为重要的一环,在传统的药物实验中,研究者大多在体外培养细胞系或动物模型中,但这两种模型都具有局限性。而类器官在药物筛查及研究方面具备高特异性的特点[45],与其他模型相比具有独特的组织同源性,能更真实反映疾病状态并检测药物效应。NgBlichfeldt[46]等人在体外原代培养小鼠和人的肺泡上皮细胞并构建肺泡类器官,研究维甲酸对肺部疾病的作用机制,维甲酸在临床上广泛应用于肺部疾病,但治疗效果并不理想。这项研究发现,维甲酸抑制剂能激活YAP信号通路及上皮-间质细胞间的FGF信号通路,上调AT2,而激活维甲酸相关通路能促进AT2分化为AT1,这一研究提示暂时性抑制维甲酸信号通路可能促进肺泡上皮细胞的修复。另一项研究构建肺泡类器官进行药物筛选发现氨来占诺可作为Wnt/β-catenin通路激活剂促进肺泡类器官生成,同时可改善肺气肿小鼠的肺功能[47],对临床用药的发展具有指导意义。根据美国食品药品监督管理局的数据显示,有高达90%的药物经动物实验检测被认为安全有效后在临床试验中失败,其原因主要是具有毒性或未实现预期的效果[48]。因此,构建能够直接预测人类反应的模型十分重要,可更为准确的评估药效及毒性。在体外构建人类肺泡类器官,可弥补细胞模型和动物模型的缺陷,为快速有效筛选慢性阻塞性肺疾病的治疗药物提供新思路。

五、肺泡类器官在慢阻肺中的应用前景

类器官是构建疾病模型及研究器官再生的有利工具,相比与传统的细胞模型和动物模型具有优越性,可以减少动物在疾病研究中的使用。肺泡类器官在慢阻肺发病机制研究、寻找新的治疗靶点及药物筛选等方面具有巨大的应用潜力,但也具有局限性。目前构建的人肺泡类器官包含多种肺泡上皮细胞,缺乏血管内皮细胞、平滑肌细胞及免疫细胞,未重视微环境对其发生发展的影响[49],不能完全模拟肺脏,该模型体外培养需要较长的时间,且细胞并未完全分化,需要在体内进一步生长、分化。另外,肺泡类器官目前尚无标准化培养方案,使用化学成分不明的细胞外基质会影响细胞的生长发育,最新的研究发现添加其他种类的外源性细胞可提高类器官模型的准确性[50],未来仍需进一步探索。

类器官的发展极大推动了疾病的研究,随着类器官培养技术的完善,研究者可以构建更为准确的人类器官模型,也可以对正常状态的类器官施加刺激,模拟致病因素对器官结构、功能的影响。肺泡类器官为疾病在肺泡结构层面的病理生理变化、发病机制和相关信号通路提供了新的研究方法,有助于针对各疾病的相应靶点筛选有效药物从而进一步推进临床试验研究。随着各种类器官的培养技术不断标准化,这种模型将被更多的运用在基础研究中,未来技术成熟后,可对不同患者提取病变部位的干细胞,培养对应的类器官而后制定个性化治疗方案,为研究个体对治疗的反应和个性化用药开辟新途径。