不同浓度阿达帕林诱导SH-SY5Y细胞的分化及凋亡

刘娜娜 张俊娇 张樊 吴聪英 姜玉武

（1.北京大学第一医院儿科，北京 100034；2.儿科遗传性疾病分子诊断与研究北京市重点实验室，北京 100009；3.北京中医药大学东直门医院针灸科，北京 101121）

神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）是儿童时期最常见的颅外实体瘤，主要见于婴幼儿，约占儿童癌症相关死亡率的15%［1］。它是一种起源于神经嵴的发育性肿瘤［2］。NB 预后差异较大，可自行消退，发展为良性神经节细胞瘤，以及逐渐进展为难治性肿瘤［3］。促进肿瘤细胞分化及凋亡的分子可能为治疗NB的有效候选药物。

神经元分化是一个复杂的生物过程，受多种信号通路调控，包括转化生长因子-β信号通路［4］、SHH 信号通路［5］、Wnt 信号通路［6］、Notch 信号通路［7］和RARs 信号通路［8］等。神经元凋亡是神经元的程序性死亡，是一种由基因决定的自我破坏过程。诱导肿瘤细胞凋亡有利于阻止肿瘤细胞的无限增殖，能有效抑制肿瘤的发生与发展。明确神经元分化及肿瘤细胞凋亡的发生，有利于神经系统疾病的治疗。

阿达帕林是一种人工合成的第三代维甲酸类药物，目前主要用于普通型痤疮等皮肤病的外用治疗［9-10］。有研究表明，阿达帕林可诱导黑色素瘤细胞（A375 和M14 细胞）［11］和角质形成细胞（HaCat 细胞）的增殖和凋亡［12］；阿达帕林可抑制三阴性乳腺癌TNBC 细胞的生长、集落形成和迁移［13-14］；在结直肠癌细胞系中抑制肿瘤细胞增殖及诱导其凋亡［15］，从而发挥抗肿瘤作用。然而，该药物对NB和神经元发育的影响尚不明确。本研究旨在研究不同浓度阿达帕林对神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y 的影响，为阿达帕林可能用于治疗NB提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 SH-SY5Y细胞培养

SH-SY5Y 细胞系由北京大学神经科学研究所王韵教授所赠。SH-SY5Y 细胞用含10%胎牛血清（Gibco，美国）和1%青霉素-链霉素溶液（Gibco，美国）的DMEM/F12培养基（Thermo Scientific，美国），培养于细胞培养皿中。置于37℃、5% CO2及95%湿度的培养箱（Thermo Scientific，美国）中孵育。培养基每周更换2次。

1.2 阿达帕林处理

将培养皿中密度为70%～80%的SH-SY5Y 细胞用0.25%胰蛋白酶（Gibco，美国）室温消化30 s，加入SH-SY5Y细胞培养基终止消化，离心后取SHSY5Y 细胞沉淀，PBS 洗涤3 次后培养于新的培养皿中。SH-SY5Y 细胞传代后第2 天，采用3 种不同浓度，即0.1 μM（低浓度）、1 μM（低浓度）、10 μM（高浓度）阿达帕林（Med Chem Express，美国）处理SH-SY5Y 细胞。在阿达帕林处理后7 d内，观察SH-SY5Y 细胞的形态变化过程。细胞实验分为对照组和0.1 μM、1 μM、10 μM 阿达帕林组。

1.3 延时显微拍摄

采用延时显微拍摄技术观察各组SH-SY5Y 细胞形态的动态变化。将SH-SY5Y 细胞置于INU 显微镜培养箱（Tokai Hit，日本）中孵育，设置该培养箱参数为37℃和5% CO2。使用CKX41 倒置显微镜（Olympus，日本）于第1、3、7 天进行拍摄，观察并记录同一区域SH-SY5Y 细胞及其突起的形态变化情况。

1.4 免疫荧光染色

1 μM 阿达帕林处理SH-SY5Y 细胞后，用4%多聚甲醛固定20 min，然后用0.3% Triton X-100 处理15 min。用含3%牛血清白蛋白和0.1% Triton X-100 的封闭液在室温下封闭1 h，加入兔抗β-微管蛋白Ⅲ（βⅢ-tubulin；CST，美国；1∶400）和小鼠抗神经丝重链多肽（neurofilament heavy polypeptide，NFH；CST，美国；1∶400）一抗，4℃下过夜。PBS 洗涤3 次后，加入Alexa Fluor 488（Invitrogen，美 国；1∶500） 和Alexa Fluor 568（Invitrogen，美国；1∶500）二抗，室温下孵育1 h。在室温下用2 μg/mL Hoechst 33258处理15 min以使细胞核染色，于共聚焦显微镜（Olympus，日本）下进行观察。实验独立重复4次。

1.5 多电极阵列记录

利用多电极阵列（3Brain，瑞士）技术记录阿达帕林诱导SH-SY5Y 细胞的自发放电活动。将未处理的SH-SY5Y细胞培养在多电极阵列CMOS芯片（Plexon，中国香港）上，用1 μM阿达帕林进行处理后，继续培养于CO2孵育箱中。予1 μM 阿达帕林处理4 d后进行自发放电活动监测，每组于同一时间点均至少记录5 min，使用BrainWave 4分析软件（3Brain，瑞士）进行离线分析。实验独立重复3次。

1.6 细胞凋亡检测

将SH-SY5Y 细胞培养于共聚焦显微镜皿内，予10 μM 阿达帕林处理1 d，按照磷脂结合蛋白Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（C1062L，碧云天，中国）和活细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3 活性与Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒（C1077M，碧云天，中国）说明书进行检测。Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide， PI）双染为每皿细胞加入195 μL Annexin V-FITC 结合液、5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染色液的混合液；caspase-3/Annexin V 双染为每皿细胞中加入194 μL Annexin V-mCherry 缓 冲 液、 5 μL Annexin VmCherry 和1 μL GreenNuc ™ caspase-3 Substrate（1 mM）混合液。将上述混合液分别摇匀后于室温下避光孵育20 min。随后于共聚焦显微镜下进行观察。实验均独立重复5次。

1.7 统计学分析

使用GraphPad Prism软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均值±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度阿达帕林对SH-SY5Y 细胞形态的影响

对照组SH-SY5Y 细胞突起较少且短。给予0.1 μM 阿达帕林处理后，SH-SY5Y 细胞被诱导形成较长突起，且突起可见分支，随培养时间延长，突起之间可相互连接形成网络。1 μM 阿达帕林处理后，SH-SY5Y 细胞被诱导形成较长且分支状突起，随培养时间延长，突起之间也可相互连接形成网络。10 μM 阿达帕林处理后，第1 天SH-SY5Y细胞突起较长，可见分支；第3、7 天SH-SY5Y 细胞突起消失，胞体呈球形。见图1。

图1 不同浓度阿达帕林处理第1、3、7天SH-SY5Y细胞形态变化（×20） 对照组细胞突起较少且短。不同浓度阿达帕林处理后，0.1 μM、1 μM阿达帕林组细胞突起较长，可见分支；随培养时间延长，突起之间可相互连接形成网络。10 μM阿达帕林组处理后第1天细胞突起较长，可见分支；第3、7天细胞突起消失，胞体呈球形。

图2 1 µM阿达帕林处理4 d后SH-SY5Y细胞βⅢ-tubulin及NFH表达（共聚焦显微镜，×60） βⅢ-tubulin阳性表达为绿色荧光、NFH阳性表达为红色荧光。与对照组相比，1 μM阿达帕林组βⅢ-tubulin和NFH的相对荧光强度升高。

2.2 1 μM 低浓度阿达帕林诱导SH-SY5Y 细胞突起形成过程中的βⅢ-tubulin和NFH表达

与对照组相比，1 μM 阿达帕林组SH-SY5Y 细胞βⅢ-tubulin 和NFH 的相对荧光强度升高（分别为57.3±6.1 vs 65.4±3.5，44.5±1.7 vs 65.5±13.3；P＜0.05）。提示低浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y 细胞突起形成，即神经纤维的形成；同时，可诱导SH-SY5Y细胞向成熟神经元分化。

2.3 低浓度阿达帕林诱导SH-SY5Y 细胞的功能变化

结果显示，0.1 μM 及1 μM 低浓度阿达帕林处理SH-SY5Y 细胞4 d 后，均可观察到自发电活动（图3）；对照组中未观察到自发电活动。提示低浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y 细胞分化成为成熟的功能性神经元。

图3 低浓度阿达帕林处理SH-SY5Y 细胞4 d 后电活动的多电极阵列测定 0.1 μM（A）和1 μM（B）阿达帕林组可观察到自发电活动。

2.4 高浓度阿达帕林对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

与对照组相比，10 μM 阿达帕林组Annexin V和PI 的相对荧光强度升高（分别为71.2±3.2 vs 96.3±19.5，51.4±1.1 vs 56.4±2.5；P＜0.05），而且可观察到Annexin V和PI的部分共染现象。见图4。提示高浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y 细胞的凋亡。

图4 10 µM阿达帕林处理1 d后SH-SY5Y细胞的细胞凋亡情况（共聚焦显微镜，×60） Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。与对照组相比，10 μM阿达帕林组Annexin V和PI相对荧光强度升高。

与对照组相比，10 μM阿达帕林组caspase 3和Annexin V 的相对荧光强度升高（分别为51.6±4.9 vs 77.8±13.5，65.4±3.5 vs 133.6±63.4；P＜0.05），而且可观察到caspase 3 和Annexin V 的部分共染现象。见图5。提示高浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y细胞凋亡，这一凋亡作用可能由caspase 途径介导。

图5 10 µM 阿达帕林处理1 d 后SH-SY5Y 细胞中caspase 3 活性和细胞凋亡情况（共聚焦显微镜，×60）细胞内caspase 3 活性高的凋亡细胞核呈绿色荧光，凋亡细胞的细胞膜呈红色荧光。与对照组相比，10 μM 阿达帕林组caspase 3及Annexin V相对荧光强度升高。

3 讨论

SH-SY5Y 细胞是由人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞经历克隆形成，被广泛用于神经系统疾病研究［16-18］。未分化的SH-SY5Y 细胞不完全具备神经元的特征，而分化成熟的SH-SY5Y 细胞可具备成熟神经元的特征，如形态学上可见明显细胞突起，功能上细胞兴奋性增强，可通过添加多种化合物诱导SH-SY5Y 细胞的分化［19］，并可通过添加特定物质诱导其分化成特定类型神经元［20］。该细胞系状态稳定且易于生长。

以往研究中，维甲酸是维生素A 活性代谢产物之一，通常被用来将神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y细胞诱导分化为神经元［21］。本研究中，使用阿达帕林研究其对SH-SY5Y细胞的诱导分化作用，使用不同浓度阿达帕林处理SH-SY5Y 细胞，通过采用延时显微拍摄技术于不同时间点观察SHSY5Y 细胞形态，结果提示低浓度阿达帕林可促进SH-SY5Y 细胞的突起形成，突起之间形成网络结构进而促进细胞之间的相互联系。由此可知，SHSY5Y 细胞可被诱导分化为神经元样细胞，可以观察到神经元样突起形成。为明确低浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y 细胞成神经元，本研究通过免疫荧光观察神经元特异性标志物βⅢ-tubulin 和成熟神经元标志物NFH 的表达情况。结果表明，低浓度阿达帕林组SH-SY5Y 细胞βⅢ-tubulin 和NFH 表达高于对照组。NFH具有稳定神经元轴突的作用，常作为成熟神经元的重要标志物。以上提示，低浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y 细胞分化为成熟神经元。为了明确低浓度阿达帕林诱导分化的成熟神经元功能，本研究采用多电极阵列技术对诱导分化后的SH-SY5Y 细胞进行电生理记录，观察到低浓度阿达帕林诱导分化后的SH-SY5Y 细胞有自发放电活动，提示低浓度阿达帕林可诱导SHSY5Y 细胞成为成熟的功能性神经元。这与以往研究中使用AM580 诱导SH-SY5Y 细胞分化为有功能的成熟神经元的研究结果一致［19］。

促进肿瘤细胞凋亡是大多数抗肿瘤药物发挥药效的重要机制。既往研究证实，随培养时间延长，不同浓度阿达帕林（2.5 μM、5 μM、10 μM）可抑制黑色素瘤A375 和M14 细胞的集落形成，通过抑制DNA 修复进而引发细胞显著的S 期阻滞和凋亡［11］；另有研究表明，不同浓度阿达帕林（2 μM、4 μM、6 μM）可抑制HaCat细胞的克隆形成，引起细胞S期阻滞和凋亡，这一机制可能使阿达帕林用于表皮增生性疾病的治疗［12］。在本研究中，为了明确高浓度阿达帕林对SH-SY5Y 细胞的影响，阿达帕林处理浓度升至10 μM，发现SHSY5Y 细胞突起逐渐消失，胞体逐渐回缩成球形，随培养时间延长，上述现象逐渐明显。为了进一步明确高浓度阿达帕林对SH-SY5Y 细胞凋亡的影响，通过检测细胞凋亡标志物，结果表明，高浓度阿达帕林组SH-SY5Y 细胞表达神经元早期凋亡标志物磷脂结合蛋白Annexin V、晚期凋亡及坏死标志物PI 以及神经元凋亡标记物caspase 3 均高于对照组。以上表明，高浓度阿达帕林可以诱导SHSY5Y细胞凋亡。

综上所述，本研究发现低浓度和高浓度阿达帕林对SH-SY5Y 细胞分别具有诱导分化为成熟的功能性神经元和诱导凋亡的作用。为NB的临床有效药物治疗提供实验依据。

作者贡献声明：刘娜娜负责SH-SY5Y 细胞多电极阵列检测细胞放电实验及细胞凋亡检测实验、实验数据分析、文章撰写和修改；张俊娇负责SHSY5Y 细胞的培养及形态学观察实验；张樊负责SH-SY5Y 细胞的培养及不同浓度药物处理；吴聪英老师提供实验技术支持，帮助进行数据分析和统计，修订文章初稿；姜玉武教授提供基金支持，负责课题的设计、指导和监督，并在实验过程中提供宝贵的专业意见。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。