脑小血管病血浆外泌体miRNA差异表达及其意义

王铮 王源 马爱军

［收稿日期］2023-03-08;  ［修訂日期］2023-05-22

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81971111）

［第一作者］王铮（1995-），男，硕士研究生。

［通信作者］马爱军（1971-），女，博士，主任医师，博士生导师。E-mail：drmaj@qdu.edu.cn。

［摘要］  目的

探讨血浆外泌体miRNA在脑小血管病（CSVD）病人中的表达谱及临床应用价值。

方法  选择CVSD病人66例和健康体检者66例血液标本，分离血浆外泌体；随机选取其中16例CVSD病人和16例健康对照者血浆外泌体进行基因芯片检测构建差异表达的miRNA文库，对132例样本行PCR以检验测序结果。进行GO富集分析和KEGG分析。

结果  基因芯片测序显示，CVSD病人血浆外泌体中差异表达的miRNA共有38个，其中上调表达18个，下调表达20个。与健康对照者相比，miR-498、miR-320e、miR-6776、miR-455表达明显下调。实时荧光定量PCR验证结果与基因芯片结果一致。CVSD病人血浆外泌体miR-320e的表达水平较健康对照组显著下调，差异有统计学意义（t=4.661，P<0.001）。生物信息学分析表明，差异表达的miRNA的靶基因参与了细胞凋亡、阿尔茨海默病、FoxO信号通路、Wnt信号通路等生物学过程。

结论  CVSD病人血浆外泌体miRNA表达谱与健康对照者存在明显差异，miRNA可能通过靶基因及生物信号通路的调控作用参与了CVSD的发生与发展。

［关键词］  脑血管障碍；外泌体；微RNAs；生物标记；基因组学

［中图分类号］  R743.9

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0033-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.033

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240329.0927.002;2024-04-01  12：08：22

Differentially expressed plasma exosomal miRNAs and their significance in patients with cerebral small vascular disease

＼ WANG Zheng， WANG Yuan， MA Aijun

＼ （Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266001， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the expression profile of plasma exosomal miRNAs and their application value in patients with cerebral small vascular disease （CSVD）.

＼ Methods＼ Blood samples were collected from 66 patients with CVSD and 66 healthy controls， and then plasma exosomes were isolated. Plasma exosomes were randomly selected from 16 patients with CVSD and 16 healthy controls， and gene microarray was used to construct a library of differentially expressed miRNAs. PCR was performed for all 132 samples to verify the results of sequencing. Gene ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis were performed.

＼ Results＼ Gene microarray showed a total of 38 differentially expressed miRNAs in plasma exosomes of CVSD patients， among which 18 were upregulated and 20 were downregulated. Compared with the healthy control group， the patients with CVSD had significantly downregulated miR-498， miR320e， miR-6776， and miR-455. The results of quantitative real-time PCR were consistent with gene microarray results. The patients with CVSD had a significantly downregulated expression level of plasma exosomal miR-320e compared with the healthy control group （t=4.661，P<0.001）. The bioinformatics analysis showed that the target genes of differentially expressed miRNAs were involved in the biological processes including cell apoptosis， Alzheimers disease， the FoxO signaling pathway， and the Wnt signaling pathway.

＼ Conclusion＼ There is a significant difference in the expression profile of plasma exosomal miRNAs between CVSD patients and healthy controls， and miRNAs may be involved in the development and progression of CVSD through the regulation of target genes and biological signaling pathways.

［Key words］＼ cerebrovascular disorders; exosomes; microRNAs; biomarkers; genomics

腦小血管病（CSVD）是由各种病因引起的影响脑内小动脉、微动脉、毛细血管、微静脉和小静脉所致的一系列临床、影像、病理综合征，占缺血性卒中的25%～30%，是一类临床常见的脑血管疾病。衰老、高血压病史和总胆固醇水平升高是CSVD的独立危险因素［1-2］，常规降压、调脂、抗血小板聚集治疗均无法有效改善病人的认知及运动功能损害［3-4］。由于CSVD起病隐匿、机制复杂、临床表现多样，因此迫切需要寻找灵敏度、特异度较高的检测标志物提高其诊疗水平。微小RNA（miRNA）是一类小分子非编码RNA，其长度在20 nt左右，通过与靶基因的3′非编码区相结合，以转录后修饰的方式发挥对下游通路的调控作用，参与多种疾病的进程［5-6］。外泌体是直径在40～100 nm之间、表面含有典型标记蛋白的一类细胞外囊泡［5］，细胞外miRNA可以富集在外泌体中且受其表面膜的保护而具有很好的稳定性，外泌体包裹的miRNA能影响靶细胞的生物学功能和细胞行为［7］。本研究对CSVD病人外泌体miRNA表达谱进行检测，并进行生物信息学分析，探讨其功能。

1  资料与方法

1.1  对象及分组

收集2017年1月—2019年1月我院收治66例CVSD病人（CVSD组）和66例健康体检者（对照组）的血液标本。CVSD病人诊断符合头颅影像学上脑损伤的间接征象血管变化的神经影像学报告标准［8］：①MRI表现为血管源性腔隙、血管源性白质高信号、脑微出血和血管周围间隙扩大>2 mm和脑萎缩；②发病时伴有头昏、疲乏、认知改变等临床症状；③年龄>40岁。排除标准：①明确诊断为心脑血管疾病及严重的头颈大动脉狭窄、动脉硬化，脑MRI检查不全者；②血液系统疾病或肿瘤者；③严重肝肾功能不全者。

1.2  标本采集与处理

分别采集病人和健康体检者清晨空腹静脉血，装入15 mL离心管中，4 ℃条件下、1.68×106 r/min离心10 min后，吸取上层淡黄色血浆，加入 PBS 至10 mL体积，4 ℃条件下、1.12×106 r/min离心10 min，弃去管底沉渣，留取上层血浆，-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3  外泌体提取

实验使用蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific 4485229）以及Total Exosome Precipitation Reagent（REF4484451，Thermo Fisher Scientific公司）试剂盒提取外泌体。按照试剂盒说明书方法进行操作。得到外泌体溶液，立即进行下一步操作或者-80 ℃冰箱保存备用。

1.4  外泌体鉴定

使用透射电子显微镜观察外泌体形态，纳米颗粒追踪分析技术对所分离的外泌体进行质量鉴定。对外泌体表面蛋白质进行检验。

1.5  Western blot法检测外泌体膜蛋白

将外泌体溶液解冻后取100 μL加入RIPA裂解液，使用BCA试剂盒测蛋白浓度。将蛋白样品加

入SDS-PAGE（ACE）胶的凹槽中，对蛋白质进行电泳分离，电泳结束后将蛋白转移到 PVDF膜上，用含有50 g/L脱脂牛奶的TBST 溶液在室温下封闭1 h，分别加入CD9、CD63、TSG101 和 GAPDH 一抗，在摇床上振荡培养1 h，置-4 ℃冰箱中过夜。第2天室温复温后先用TBST 溶液清洗PVDF膜3次，每次10 min，然后加入酶标二抗室温孵育2 h，再次用TBST 溶液清洗3次，最后使用 ECL化学发光试剂盒进行显影，获取蛋白条带图。

1.6  外泌体RNA的提取

使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）（Cat. No.217184）试剂盒提取总RNA。将冻存的外泌体溶液融化后，取100 μL加入TRIzol 500 μL 裂解，室温孵育5 min。加入100 μL氯仿涡旋振荡后，在室温下孵育3 min。随后按试剂盒说明书方法进行操作，提取RNA。

1.7  构建RNA文库

miRNA文库的构建由上海吉凯基因医学科技公司协助，使用Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 （miRNA表达谱芯片，100 format，902446） 完成。采取每4人一组混检的方式，CVSD组与对照组每组随机选取16例进行检测。

1.8  差异表达RNA的验证

根据基因芯片结果，选择4个差异表达倍数（FC）>1.5、P<0.05的miRNA （miR-320e、miR-498、miR-455、miR-6776）进行验证。采用MiR-X miRNA First-Stand Synthesis Kit（Cat#638313）试剂盒，对 1.3 中提取的细胞总RNA进行反转录，得到 cDNA，用其作为模板进行荧光定量PCR反应。PCR反应引物及其序列见表1。选用RNU6基因作为内参，使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNAseH Plus）（Cat#RR820A）SYBR Green荧光染料法，以cDNA为模板，在PCR扩增仪上进行扩增。按试剂盒说明书方法进行操作和程序设定，循环数50个，结果以2-△△Ct表示。

1.9  靶基因的预测及功能分析

通过TargetScan网站（https：//www.targetscan.org）、RNACentral（https：//rnacentral.org）、TarBase V.8（https：//dianalab.e-ce.uth.gr）在线预测miRNA靶基因，利用Metascape对靶基因进行GO分析和KEGG生物信息学分析，显示miRNA的靶基因参与的生物学过程。

1.10  统计学分析

使用SPSS 21.0和Graphpad软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。使用Graphpad、TBools［9］、Metascape［10］软件绘图。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2  结  果

2.1  两组一般资料比较

CVSD病人66例中，男38例，女28例；年龄43～87岁，平均（66.46±10.52）岁；其中高血压26例，糖尿病9例。对照组66例中，男36例，女30例；年龄47～85岁，平均（63.90±11.63）岁；高血压21例，糖尿病7例。CVSD组与对照组一般临床资料比较，差异无显著性（P>0.05）。见表2。

2.2  外泌体形态

透射电镜观察显示，外泌体形态呈圆形或椭圆形，直径30～150 nm（图1A）。Western blot检测显示，外泌体膜表达标志蛋白CD9、CD63、TSG101（圖1B）。

2.3  两组血浆外泌体miRNA的差异表达

血浆外泌体中miRNA基因芯片检测结果显示，与对照组相比，CVSD组血浆外泌体中差异表达的miRNA共有38个（FC>1.5，P<0.05），其中表达上调18个，表达下调20个（图2A、B），其分布热图见图2C。

2.4  差异表达miRNA的PCR验证

对筛选出的差异表达miRNA在66例CVSD病人及66例对照者中进行qPCR验证，验证结果与基因芯片趋势一致，其中CVSD病人血浆外泌体miR-320e、miR-498的表达水平较对照组明显下调，差异具有统计学意义（t=4.661、2.145，P<0.05）。见表3。

2.5  靶基因GO分析与KEGG分析

对差异表达miRNA的靶基因进行预测和生物信息学分析结果显示，KEGG主要富集于代谢通路、PI3K/Akt信号通路、FoxO信号通路、Wnt信号通路、凋亡通路和阿尔茨海默病相关通路（图3）。GO富集分析显示，排前10位的生物信息学过程分别为Rho GTP酶参与的信号传导（Rho GTPases、Miro GTPases 和 RHOBTB3 信号转导）、肌动蛋白细胞骨架组织（actin cytoskeleton organization）、脑源性神经营养因子信号通路（BDNF signaling pathway）、细胞对压力反应的调节（regulation of cellular response to stress）、衰老（aging）、细胞分裂（cell division）、细胞凋亡（apoptosis）、内膜系统构建（endomembrane system organization）（图4）。

通过Metascape网站（https：//metascape.org）基于STRING6、BioGrid7、OmniPath8、InWeb_IM9数据库进行分析，得到了蛋白-蛋白互相作用（PPI）网络图（图5A）。在PPT网络中，通过MCODE算法进行量化评估得出3组分值最高的PPI过程，它们分别为多途径神经退行性变（Pathways of neuro-

3  讨  论

CVSD的发生与发展是一个多因素、多机制参与的过程，随着衰老的自然发生和各种血管危险因素的侵袭，

如高血压、糖尿病、低密度脂蛋白升高［11］

和氧化应激，颅内血管的功能逐渐下降，结构完整性

也逐渐丧失。由于神经-血管耦联现象的存在，参与耦联的任何环节发生的功能紊乱都将导致更广泛的病理改变和临床症状［12］。CVSD通常隐匿进展，多数患有CVSD的病人通常在发生脑出血或梗死、认知能力下降等后果时才被发现［13-14］。目前研究已经证明，miRNA可以通过靶向调控mRNA表达而调控血管新生和成熟［1］、维持血管壁完整性［2］、调控细胞行使各种功能［3］。RNA、DNA、蛋白质、脂质可以被包裹在外泌体中进行传递并且不会引发自身免疫反应［6］。

人们可以通过外泌体内容物的选择性包裹或工程化外泌体膜，从诊断和治疗等多个角度对外泌体加以利用［15］。

目前，关于外泌体和miRNA及其靶基因在CVSD中作用机制尚不清楚。本研究基因芯片测序结果显示，CVSD病人血浆外泌体中差异表达的miRNA共有38个，表达上调18个，表达下调20个，其中miR-668-5p、miR-498、miR-320e等出现了明显下调，miR-6089、miR-3665、miR-4466等出现了显著上调。miR-320e的靶基因HES2受抑制可以导致Notch信号通路介导的平滑肌细胞迁移受到抑制，从而干扰血管重塑［16］。ORMDL1基因被认为是鞘脂生物发生的关键负调节因子，是miR-320e的靶基因之一。ORMDL1基因异常将导致严重的脱髓鞘和炎症过程［17-18］。Wnt基因是miR-320e的靶点之一，Wnt/β-Catenin表达上调有利于脑损伤后血管修复过程［19］，调节血管新生和血-脑脊液屏障成熟［20］，但持续的Wnt/β-Catenin激活也会导致白质病变和中枢系统炎症损伤［21-22］，抑制Wnt/β-catenin信号通路有利于抑制帕金森病模型中成神经细胞瘤的进展和减弱轴突变性［23］。因此我们推测，miR-320e可能通过靶向Wnt/β-Catenin信号通路发挥疾病保护作用。外泌体miR-498可以靶向抑制Prdx4过氧化物酶，Prdx4升高能引起显著增强的IL-1β依赖性炎症反应［24］，miR-498下调可能促进CVSD的进展；miR-320e和miR-498显著下调可能导致其对相应靶基因的转录后抑制作用缺失，而抑制缺失可能产生的病理改变与已知的CVSD的病理改变相一致。此外，差异表达文库中表达上调的miR-6087通过靶基因调节神经元凋亡［25］。miR-6087的靶蛋白RhoG的降解或缺失会导致血小板功能的改变是微血管血栓形成的一个影响因素［26］。

生物信息学分析结果显示，KEGG显著富集到细胞代谢通路、PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、Wnt信号通路、细胞凋亡、阿尔茨海默病；GO富集显示，上述差异表达的miRNA的靶基因广泛地参与了细胞对压力反应的调节、衰老、细胞分裂、细胞凋亡、内膜系统构建，这些生物学过程与CVSD的血管壁破坏、血-脑脊液屏障破坏、胶质细胞凋亡、白质病变的发生和进展均相关，这与已知的CVSD病理改变相符。

PPI图可展示通过异构、修饰等作用发生物理结合的蛋白质，每个节点代表相应生物学过程，节点越大，表明参与该生物学过程的蛋白质越多。本文PPI网络分析显示，CCT2、RPS19、OYNLL2、CDK6相互联系，并且是与其他蛋白连接的核心蛋白。伴侣蛋白CCT2是一种自噬受体，可调节细胞内聚集蛋白的清除過程，其下调会导致血管内皮细胞损伤。血管内皮细胞损伤将破坏脑血管系统的完整性，造成动脉血管僵硬、自主神经失调、神经-血管解耦联和血-脑脊液屏障损伤，破坏脑血流和局部灌注的动态平衡，进而促进CVSD的发生和进展。

综上所述，CVSD病人血浆外泌体miRNA表达谱存在差异，差异表达谱中miRNA通过其靶基因发挥维持血管结构完整性、调节小血管功能和调控神经细胞功能的作用，从而可能在CVSD中发挥调控作用。多个miRNA可能联合发挥作用，miR-320e、miR-498的下调和miR-6087、miR-3960的上调可能促进CVSD的进展，这些miRNA如何参与CVSD的机制目前尚不清楚。本研究的不足之处：未对CVSD病人近期皮质下小梗死、腔隙、微出血、脑萎缩、认知功能障碍等临床表现分型的miRNA差异表达谱进行进一步分类检测。今后研究将扩大样本量进一步对本文结论进行验证，并深入探讨差异表达miRNA调控的下游基因在CVSD发生发展中的分子机制。

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（本文編辑  黄建乡）