肿瘤相关成纤维细胞对结直肠癌肿瘤微环境中免疫细胞调节作用的研究进展

危姗姗，徐逸昕，朱仔燕，陈皓南，阿不都沙拉木·亚力昆，李继坤

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率分别居全球肿瘤的第三位和第二位[1]。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）是决定肿瘤发生发展及治疗效果、预后的关键因素，TME 主要由肿瘤细胞、浸润性免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）、 细胞 外基 质（extracellular matrix, ECM）和脉管系统等构成[2-4]。在各种TME 中，CAFs 是最丰富的细胞类型之一，在影响肿瘤恶性表型方面起着极其重要的作用，并且以CAFs 作为肿瘤治疗的靶标也逐渐引起了人们的关注。

人们将TME 中的活化成纤维细胞定义为CAFs，其经典的生物学标志物为α-平滑肌动蛋白(α-SMA)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。CAFs 是肿瘤基质中的主要组成成分，其作用为分泌生长因子、炎症配体和细胞外基质蛋白，促进肿瘤增殖和免疫抑制[5]。CAFs 的主要来源有：1）肿瘤激活邻近的正常成纤维细胞，获得肌成纤维细胞表型[6-8]；2)骨髓源性纤维细胞的募集[9-10]；3) 上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）[11]；4)内皮- 间质转化（endothelial -to -mesenchymal transition, EndMT）[12]。

近年来，人们除了对CAFs 在促进肿瘤的发生和发展中的作用有了比较深入的认识以外，有关CAFs 与TME 中其他免疫细胞之间的相互作用以及对肿瘤免疫治疗的影响也展开了许多研究。本文将就有关CAFs 对结直肠癌TME 中主要细胞成分的调节及影响肿瘤免疫治疗的进展研究进行综述。

1 TIME 中免疫细胞浸润是影响肿瘤进展及免疫治疗效果的关键因素

肿瘤免疫微环境 （tumor immune microenvironment,TIME）是近年来新提出的概念，据报道其与患者的免疫治疗效果和临床预后密切相关[13]。目前，随着免疫治疗的发展，治疗恶性肿瘤的方式逐渐多样化，但其发挥效应取决于TME 中的免疫应答状态，包括免疫细胞的浸润、细胞表面免疫检查点的表达和相关基质的改变[14-15]。肿瘤实质中缺乏免疫细胞浸润是导致患者不能从免疫治疗中获益的关键因素，进而导致恶性肿瘤的进展[16-17]。

2 CAFs 对结直肠癌TME 中T 细胞的影响

在各种类型的免疫疗法中，免疫检查点阻断是基于单克隆抗体的疗法，也是在临床上应用于患者最多的方式之一。临床上常用的免疫治疗有：通过阻断受体-配体相互作用、增强T 细胞的活化和功能，例如抗程序性死亡受体1（PD-1）和抗细胞毒性T 淋巴细胞抗原4（CTLA-4）。CAFs 影响结直肠癌TME 中的免疫状态，从而导致抗肿瘤免疫抑制。以下就结直肠癌中CAFs 对T 细胞调控的具体机制进行阐述。

参与抗肿瘤免疫的细胞主要是细胞毒性淋巴细胞（cytotoxic lymphocytes，CTLs），而其中起最大杀伤作用的是CD8+T 细胞。CAFs 通过多种方式影响CD8+T 细胞的生物学功能。目前，靶向PD-1/程序性死亡配体1（PD-L1）和CTLA-4 的免疫检查点抑制剂在多种恶性肿瘤被应用[18-20]。然而，大多数患者对于检查点单药治疗无响应[21-23]，耐药性产生的原因是全球研究者最为关注的热点之一。对多种肿瘤的研究发现富含CAFs 的瘤种对抗PD-1 治疗的疗效较差。其机制之一在于CAFs 自身表达PD-L1 和PD-L2 或者促进CRC 细胞表面的PD-L3 和PD-L1表达，导致CD8+T 细胞对癌细胞的杀伤作用减弱[24-26]。另外，CAFs 通过限制CD8+T 细胞向肿瘤中心浸润来减少免疫细胞对肿瘤的攻击。例如，Kirsty 等[27]在MC38 小鼠体内研究发现，与低CAFs 的肿瘤相比，富含CAFs 的肿瘤对抗PD-1 治疗的疗效较差。他们用多种方法检测了免疫细胞的定位，发现CAFs显著改变了CD8+T 细胞的分布，促使CD8+T 细胞积聚在肿瘤边缘而非肿瘤中心。一项针对CRC 患者的研究表明，CD70 阳性的CAFs 促进了调节性T 细胞募集和迁移，并显著增加了这些抑制性免疫细胞对TME 的浸润[28]。而另一项研究发现CD70 阳性CRC 患者的生存率较低[29]。

众所周知，转化生长因子-β（TGF-β）是调节CAFs 分化的重要因子，而NOX4 是TGF-β 信号通路下游的靶点之一，并也参与了CAFs 分化[30]。反之，CAFs 也可促进TGF-β 的分泌和活化，从而抑制CD8+T 细胞的增殖和细胞毒性[31]。同时，CAFs 也可以通过PD-L2 和FASL 的表达诱导CD8+T 细胞凋亡[32]。根据Kirsty 等[27]的报道，使用TGF-β 抑制剂能同时增加对照组和富含CAFs 组的CD8+T 细胞浸润，在体内应用NOX4 抑制剂后，可以降低肿瘤中CAFs 的水平，肿瘤边缘的CD8+T 细胞开始由肿瘤边缘向肿瘤中心浸润，从而引起富含CAFs 的MC38小鼠肿瘤的体积减小。NOX4 抑制剂能使CRC 对抗PD-1 治疗再敏感；与抗PD-1 单药治疗相比，用NOX4 抑制剂/PD-1 抗体的组合治疗富含CAFs 的MC38 肿瘤，可以增加CD8+T 细胞的浸润，缩小肿瘤体积，延长小鼠的存活时间。此外，有研究发现CAFs 分泌的Wnt2 蛋白信号通路相关基因在TGFβ 信号传导中高度富集，从而加强了CRC 的侵袭和迁移[33]。

FAP 是一种膜结合丝氨酸蛋白酶，同时其也是CAFs 的主要标志物[34]。越来越多的证据表明，FAP 是另外一个可能导致免疫检查点阻断耐药的因素[35-37]。Chen 等[38]报道，含有FAP 高表达CAFs（CAF2）的肿瘤对抗PD-1 治疗的反应较差，而FAP 低表达的CAFs 则不会诱导肿瘤产生抗PD-1 的耐药性。另外，用FAP 抑制剂治疗可显著消除CAF2 诱导的抗PD-1 耐药性。在富含CAF2 的肿瘤中，免疫抑制因素，如骨髓来源抑制细胞(MDSC)浸润和PD-L1 表达异常升高。高FAP 表达的CAFs 通过上调CCL2分泌、募集髓系细胞、降低T 细胞活性等方式促进CRC 肿瘤免疫微环境中的免疫抑制[38-39]。上述研究表明CCL2 是FAP 高表达CAFs 诱导的CRC 免疫抑制的主要介质，生存分析发现高FAP 表达患者的总生存期较短。另有研究提示FAP 高表达的CAFs分泌的ECM 与CD8+T 细胞浸润减少有关[40-41]。

CD73 是一种外核苷酸酶，通过与外核苷-ATP-酶、CD39 等协同产生细胞外腺苷（ADO）[42-44]。腺苷是TME 中一种有效的细胞外免疫抑制信使[45]，通过细胞外ADO 腺苷能受体（A2a）施加免疫抑制[46-47]。已有研究发现CD73 在肿瘤中的过表达通过增强肿瘤细胞的侵袭性和抑制抗肿瘤免疫来促进肿瘤进展，而TME 中CD73 的重要来源之一是CAFs。Yu等[48]使用来自人CRC 和小鼠肿瘤模型中分离出来的CAFs 进行比较，发现与TME 中的其他细胞成分相比，CD73 在CAFs 上的表达和生物活性更高。在缺氧等应激条件下，CD73 与其他外核苷酸酶（如CD39）一起产生高浓度的ADO，通过与其激活的受体A2a 结合，影响肿瘤细胞和免疫细胞中的生物途径，从而影响肿瘤进展和免疫抑制[49]。而CRC 中的A2a 受体在T 细胞上表达，由ADO 激活后产生肿瘤免疫抑制作用。反之，TME 中ADO 升高还可以通过A2b 受体介导的途径上调CAFs 上的CD73，从而刺激ADO-A2b-CD73 回路，进一步增强免疫抑制。人结直肠癌TME 中高水平的CD73 表达与CAFs丰度，增强免疫抑制和预后不良呈正相关[48]。此外，有研究提示CAFs 可上调T 细胞上CD39 的表达，而T 细胞反过来上调CAFs 上CD73 的表达，由此加重抗肿瘤免疫抑制[50]。

CAFs 还通过分泌大量含胶原蛋白的ECM 来调节的免疫细胞锚定和运输、存活以及通过抑制免疫激活促进肿瘤的进展[51-53]。在含有密集堆积基质纤维的基质区域中，淋巴细胞位移减少，支持了ECM 沉积可能通过限制T 细胞运动来改变抗肿瘤免疫反应的观点[54]。由于ECM 大量堆积使肿瘤中心含氧量减少从而导致CAFs 激活，产生上述CAFs影响免疫细胞的机制，进一步促进免疫抑制[55-56]。总之，CAFs 通过自身表达和分泌一致性免疫检查点相关分子，以及促进肿瘤细胞表达免疫抑制物来促进CRC 免疫逃逸。

3 CAFs 对巨噬细胞、NK 细胞及其他细胞的影响

肿瘤相关巨噬细胞（tumor -associated macrophages，TAMs）作为TME 的重要成分在调节抗肿瘤免疫反应中起着关键作用。TAMs 在肿瘤微环境中存在两种表型，分别执行不同的功能。M1 巨噬细胞能通过激活免疫系统、产生肿瘤坏死因子产生抗肿瘤作用，而M2 巨噬细胞通过分泌免疫抑制因子发挥免疫抑制和促进肿瘤作用[40,57]。CAFs 通过各种机制诱导单核细胞在CRC 中募集并分化为M2巨噬细胞。首先，CAFs 通过白细胞介素（IL）-8/CXCR2 途径吸引单核细胞浸润至CRC 中，并通过上调结直肠癌细胞中的VCAM-1 表达和CAFs 的IL-6 分泌来促进单核细胞与CRC 黏附；其次，癌细胞介导CAFs 分泌IL-6 和GM-CSF 诱导单核细胞向M2 巨噬细胞分化，促使CRC 侵袭能力增加，导致CRC 患者的预后不佳[58-59]。巨噬细胞与CAFs 协同抑制自然杀伤（NK）细胞的功能，保护CRC 细胞免受NK 细胞介导的杀伤[57]。

NK 是浸润到TME 中的免疫细胞之一，对癌细胞有杀伤作用[60-61]。CAFs 分泌的TGF-β 可以抑制NK 细胞的活化和细胞毒性[62-63]，CAFs 还可产生高水平的促炎细胞因子PGE2，并且通过多种机制调节NK 细胞的功能[64-66]。Li 等[67]从结直肠癌标本中提取CAFs 细胞，并与NK 细胞共培养，发现CAFs产生高水平的PGE2，可以通过多种方式影响NK细胞的功能，从而产生免疫抑制，包括NK 受体活化，细胞毒性活性和细胞因子产生。CAFs 诱导的M2 巨噬细胞可抑制NK 细胞对癌细胞的杀伤功能，说明TAMs 和CAFs 在肿瘤微环境中发挥协同作用，CAFs 可以通过其他免疫细胞调节NK 细胞的功能[59]。另有研究表示，在CRC 中使用表皮生长因子受体（EGFR）抗体可以抵消CAFs 对NK 细胞的抑制作用[68]。

中性粒细胞最初是在炎症和损伤修复中发现。近年来有研究发现肿瘤相关中性粒细胞（tumor associated neutrophils, TANs）亦是TME 的重要组成成分，并促进肿瘤的生长、侵袭和转移[69-70]。TANs 参与先天性和适应性免疫调节，并受环境影响可分化为2 种不同表型，即N1 抗肿瘤亚型和N2 促肿瘤亚型中性粒细胞[71-72]。N1 和N2 之间的可塑性通过TGF-β 和干扰素-β 信号传导调节，如CAFs 通过分泌TGF-β 来诱导N2 极化，抑制TGF-β 后N1 则表达免疫激活因子和趋化因子[73]。在CRC 中，通过PGE2/EP 信号传导能促进CAFs 和TANs 的活性，从而对抗肿瘤免疫产生影响[74]。

4 小结

综上所述，CRC 中的CAFs 主要通过以下方式影响抗肿瘤免疫：1）分泌大量ECM 限制CD8+T 细胞的移动；2）通过TGF-β 通路下游的靶点NOX4使肿瘤对抗PD-1 耐药，具有FAP 高表达的CAFs的肿瘤对抗PD-1 耐药，CAFs 分泌的CCL2 是其中的主要介质；3）CAFs 自身表达CD73 产生ADO 作用于T 细胞上的A2a 受体产生免疫抑制；4）CAFs可以通过上调结直肠癌细胞中的VCAM-1 表达以及分泌IL-6 来促进单核细胞与CRC 肿瘤细胞的黏附，并诱导M2 型巨噬细胞的极化。CAFs 和M2 协同抑制NK 细胞的功能。以上内容表明，CAFs 不仅可通过分泌多种细胞因子或代谢产物抑制免疫细胞的功能，促进肿瘤的发生发展，同时还可以塑造肿瘤外基质，阻止药物及免疫细胞向肿瘤组织的深层渗透，从而降低抗肿瘤的治疗效果。未来在临床有望可以通过对CAFs 的干预联合免疫治疗，为结肠癌患者的治疗带来新思路。