肝干/前体细胞治疗失代偿期肝硬化研究进展

黄伟健 鄢和新

肝硬化是各种慢性肝病进展至以肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝窦毛细血管化为特征的病理阶段[1]。代偿期肝硬化无明显临床症状,失代偿期肝硬化以门静脉高压和肝功能严重损害为特征,患者常因腹水、消化道出血、脓毒血症、肝性脑病、肝肾综合征和癌变等导致多器官功能衰竭而死亡。据GBD(Global Burden of Disease)统计,2017年全球范围内失代偿期肝硬化患者的患病人数约为1060万例,由于目前尚无美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于治疗失代偿期肝硬化的药物,因肝硬化死亡的人数达到132万,是导致肝脏相关死亡的主要原因[2]。中国是慢性病毒性肝炎的高发国家,有接近2000万的肝硬化患者(约占人口总数1.8%)[2],对病患、医疗系统乃至社会健康管理都是沉重的负担和巨大的挑战。随着生物技术和再生医学的发展,细胞药物逐渐从动物实验发展到早期临床试验,并初步显现了一定的治疗有效性,有望成为治疗失代偿期肝硬化的新兴手段。

一、不同的细胞类型在失代偿期肝硬化治疗的临床应用现状

国内外人胎肝细胞移植在肝硬化患者中应用的小范围案例报道显示,受试者生化指标和临床症状均有显著改善[3-5]。Habibullah教授开展了胎肝细胞移植治疗肝硬化的临床研究,该研究总共纳入了280例肝硬化患者,采用EpCAM+胎肝细胞进行肝动脉移植,移植细胞量10～15×107,术中及术后均未使用抗免疫排斥药物,移植后无并发症,患者MELD或Child-Pugh评分以及所有肝脏测量指标均有明显改善,细胞定植效率在20%左右,有效时间长达4年以上[6]。诚然,胎肝细胞移植的疗效仍需要样本量更大、设计更严谨的临床研究来确定;另一方面,围绕胎肝组织来源的伦理争议极大限制了胎肝细胞移植的临床应用。

间充质干细胞(MSCs)对T细胞、B细胞和巨噬细胞发挥免疫调节作用,并可通过调节免疫和直接抑制肝星状细胞增殖和ECM合成,达到抗炎以及抗纤维化作用[7]。2014年韩国开展了一项自体BM-MSCs移植对72例酒精性肝硬化患者疗效评估的II期随机开放标签研究(clinicaltrial.gov: NCT01875081)。研究结果显示,通过肝动脉输注1～2次BM-MSC,细胞治疗组有2位受试者6个月后肝活检中胶原面积分别减少25%和37%,Child-Pugh评分改善,两组间不良事件无差异[8]。部分研究尽管证实MSC治疗具有一定疗效,然而作用却是相对短暂的。在HCV感染后的终末期肝病患者中(Clinical-Trials.gov: NCT01729221),与对照组患者相比,经外周输注MSC患者的肝功能生化指标趋于稳定(每组20例),但胶原相关标志物无显著差异[9]。同样,一项评估通过肝动脉移植自体骨髓间充质干细胞治疗HBV感染后肝衰竭的研究(Clinical-Trials.gov: NCT00956891)结果显示,相对于105例对照组,53例治疗组患者的MELD、胆红素、白蛋白和凝血酶原时间均有显著改善,然而192周时肝癌发生率以及生存率无显著差异[10]。综上,基于MSC开展的失代偿期肝硬化治疗临床试验,其长期随访数据显示MSC移植并未对失代偿期肝硬化的预后产生积极影响。

二、肝干/前体细胞在肝硬化进程中活化及其机制探讨

正常肝脏的肝细胞自我更新通常由肝细胞分裂增殖或自我复制而来。然而持续的肝脏慢性损伤(病毒感染、酗酒及脂肪性肝炎等引起的肝硬化过程)导致肝实质细胞再生功能不足,将激活“胆管上皮样细胞增殖或者化生”再生修复途径[11]。这一现象美国Popper等研究者于1957年报道为胆管反应(DR),其特征是肝脏损伤诱导的胆管上皮样细胞表型激活反应[12]。众多研究发现,该损伤活化细胞具有肝胆细胞双重特征,可被肝前体细胞(LPCs)标记物标记(EpCAM、SOX9、OV6、A6、CD24、CD133、NGA2 和CXCR4等)[13,14],具有LPCs 的生物学特性。

胆管反应中LPCs的起源、命运转归以及对肝脏再生修复的贡献作用仍未被阐明清楚。众多研究通过嵌合鼠模型表明,特殊的肝细胞亚群可转化为肝前体样细胞以促进肝脏再生修复。Bowen团队建立DPPIV+肝细胞和DPPIV-胆管上皮细胞的嵌合大鼠模型,观察到进行胆管结扎损伤后DPPIV+非肝细胞出现[15]; Grompe团队构建mT+Fah+肝细胞和Fah-胆管上皮细胞的嵌合小鼠模型,在DDC损伤后发现mT+Fah+肝前体样细胞[16]。而肝细胞在损伤状态下的重编程能力受Arid1a调控,通过开放成熟肝细胞中重编程相关基因(RRG)的染色质,从而使得成熟肝细胞转化为LPCs以应对和躲避损伤信号[17];进一步炎症信号IL-6通过肝细胞表达的受体IL6R/gp130能直接激活肝细胞STAT3信号通路,结合到受Arid1a调控的重编程相关基因的位点,从而诱导肝细胞去分化并促进了肝前体基因的表达(Sox9+LPCs)[18]。可见,肝细胞来源的肝前体细胞在慢性肝损伤修复中具有重要作用和潜在的临床应用价值。

三、肝干/前体细胞在治疗失代偿期肝硬化中的应用

近期国内外研究团队均发现,Lgr5+肝干/前体细胞移植到CCl4和DDC小鼠纤维化模型中,可明显缓解小鼠体内纤维化进程;相反,若敲除小鼠中肝前体细胞Lgr5的表达,肝纤维化将进一步加重[19,20]。进一步在体外实验中将Lgr5+前体细胞与成纤维细胞进行共培养,发现可显著抑制成纤维细胞中ki67与α-SMA表达,证明肝干/前体细胞可显著抑制纤维化进程。另一方面,Forbes团队发现通过体外分离扩增CD24+肝前体细胞并回输慢性纤维化肝脏,不但可以补充肝实质细胞,更能有效缓解肝脏纤维化进程[21];笔者团队通过小分子体系将肝细胞转化为可增殖的CD24+肝细胞来源肝前体细胞(HepLPCs)[22,23],并将其移植到CCl4小鼠纤维化模型,验证了CD24+HepLPCs同样具有相似的缓解肝纤维化乃至肝硬化的作用[24]。

肝前体/干细胞在肝硬化患者中是否可起到延缓乃至逆转肝硬化的效果?比利时Promethera Bioscience公司开展了以通过肝干细胞(HLSC;商品名HepaStem?)治疗酒精性肝硬化的II期临床研究(EudraCT 2016-001177-32)尝试回答这个问题,结果显示输注后受试者的Child评分显著下降,提示输注后肝脏功能恢复;更重要的是随后3个月随访中受试者生存率有提高,且无慢加急性肝衰竭再发[25]。笔者团队进一步在GMP 条件下优化细胞扩增条件,制备了临床级HepLPCs细胞注射液,并完成了一系列非临床研究。为了明确HepLPCs 对肝硬化治疗的安全性和有效性,笔者团队并于2021年12月在上海交通大学医学院附属仁济医院开展了全球首个“同种异体肝细胞移植治疗肝硬化的安全性和耐受性临床研究”。截至2023年9月,该临床试验已完成低、中、高剂量9例受试者入组和随访工作,结果显示安全性良好,未发生任何治疗相关的不良反应。而令人惊喜的是,几乎所有受试者在输注细胞治疗后都产生了不同程度的治疗反应性,大部分患者对比传统治疗方法病情有改善。其中,有受试者从肝硬化失代偿阶段恢复到健康状态,包括肝功能指标正常、脾脏体积减小以及食管下段静脉曲张血管的直径显著减小;目前该受试者已不需要进行肝移植治疗。

四、总结

鉴于国内外指南尚无广泛认可的失代偿期肝硬化治疗性药物,肝移植仍作为临床上治疗失代偿期肝硬化的主要手段,然而这一方法受制于肝脏供体短缺,移植后患者因免疫抑制引发感染等严重并发症,以及移植后肝纤维化再发等问题[26],难以惠及广大肝硬化患者,特别是失代偿期肝硬化患者迫切需要全新的有效的治疗手段。肝干/前体细胞因其具有来源稳定、生产安全高效以及免疫原性低的特点,未来将通过设计更完善的临床研究,纳入更多受试者,以更准确地评价其在失代偿期肝硬化的应用价值。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。