干细胞在卵巢组织冷冻与移植中应用的研究进展

成桂红，杜天奇，李惠敏，吴惠华，王馥新，孟庆霞

(南京医科大学附属苏州医院/苏州市立医院生殖与遗传中心,苏州 215002)

卵巢组织冷冻与移植作为保存女性生育能力的一种新兴技术,可为年轻女性恶性肿瘤、卵巢早衰及严重的子宫内膜异位症的患者保留生育能力。目前我国已有第一例卵巢组织冷冻移植后的宝宝在北京诞生,该女婴母亲冻存了6 块卵巢皮质组织,移植后27 个月自然妊娠[1-2]。卵巢组织移植过程中的缺血性损伤是影响移植物存活及加速卵泡闭锁致卵泡耗竭的主要原因,因此如何减少缺血性卵泡损伤成为需解决的一大难题。目前,有研究报道应用抗氧化剂[3]、抗凋亡剂[4]、干细胞[5]、3D卵巢[6]及激素[7-8]等可以提高卵巢组织冷冻与移植后的卵泡存活率。近年来,研究者们开展了关于干细胞的研究,我们将在本综述着重介绍不同组织来源的干细胞改善卵巢组织冷冻与移植后卵泡存活的研究进展及其机制,并展望在生育力保存尤其是卵巢组织冷冻移植中的临床应用前景。

一、干细胞改善卵泡存活的机制及研究进展

1.间充质干细胞(MSCs):间充质干细胞可分化为三个胚层,具有参与组织损伤修复的功能及抗炎、抗氧化、抗凋亡等特性。

(1)骨髓间充质干细胞(BMSC):近年相关研究显示,BMSC可以通过自分泌或旁分泌的机制促进冻融卵巢组织自体移植的卵泡发育及卵巢功能恢复。Xia等[9]将MSCs与卵巢皮质组织移植,推测MSCs可能通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细生长因子2(FGF2)、血管生成素(ANG)等血管生成因子,促进冻融卵巢组织移植物中新生血管持久生成,增加血液灌注进而减少原始卵泡凋亡。Zhang等[10]进一步使用细胞因子微阵列技术明确人卵巢组织共移植MSCs中与血管生成相关的关键特异性分泌因子--ANG,首次表明MSCs通过ANG介导异种移植人类卵巢组织中的血管生成和卵泡存活。此外,MSCs分泌血管生成因子还可诱导卵泡发育基因上调,Hosseini等[11]将冻融人卵巢皮片组织片段与骨髓间充质干细胞共培养8 d,发现骨髓间充质干细胞可调节卵泡发育相关基因生殖系a因子(FIGLA)、生长分化因子9(GDF9)、卵泡生成素受体(FSHR)及雌二醇(E2)的表达改善早期卵泡发育及存活,进而改善卵巢功能可改善人卵泡原位激活和冷冻卵巢组织的早期发育。

(2)脐带血间充质干细胞(UCMSC):UCMSC是一种对卵巢冷冻移植有显著治疗潜力的干细胞。Jia等[12]使用人UCMSC条件培养基体外培养人冻融卵巢组织,发现早期卵泡发育、细胞增殖和E2分泌得到改善,凋亡细胞减少,并促进微血管生成,表明UCMSC具有细胞保护作用和较高的抗凋亡特性,首次发现MSCs促进体外培养系统中冻融卵巢的恢复,参与保护过程可能与其旁分泌活性有关。Xu等[5]使用Matrigel的简单体外三维卵巢培养系统将冻融卵巢与干细胞共培养,进一步表明UCMSC在体外卵巢培养系统中通过激活Wnt/β-连环蛋白途径促进冻融卵巢血管生成;缺氧预处理的间充质干细胞可以增强血管生成的潜力,Cheng等[13]将UCMSC置于缺氧培养箱(3%O2,37℃)中培养48 h进行缺氧预处理后与卵巢组织异种移植,通过PI3K/Akt/HIF 1a/VEGF/Akt信号通路途径增加CD34、CD1和VEGFA的高表达促进早期血管生成,进而改善卵泡存活率;并显著降低细胞凋亡,进而调节卵泡死亡,保护静息的原始卵泡池,可能与HIF-1/VEGFA信号通路有关。以上MSCs对冻融卵巢的保护机制可能成为提高冷冻卵巢组织移植的治疗策略。

(3)脂肪来源间充质干细胞(ASCS):ASCS具有多谱系分化潜力、促血管生成特性以及增强异种移植人卵巢组织中血管形成的能力的作用[14],受到研究者的广泛关注。Damous等[15]将ASCS注射到成年雌性Wistar大鼠新鲜移植的卵巢,发现较早恢复发情期和增加卵巢组织中血管数量,不导致细胞凋亡或细胞增殖,因此ASCS治疗自体新鲜卵巢移植物可行且安全。邢彦彦等[16]研究也表明,大鼠卵巢自体移植过程中应用ASCS可改善大鼠卵巢自体移植效果,提高移植效率。然而直接注射ASCS至冻融移植物会造成细胞损失,并可能损害已脆弱的组织。近年来,细胞治疗已与组织工程技术相关联,以增强细胞在靶组织中的释放和保留。Damous等[17]将明胶凝胶泡沫海绵作为大鼠冻融卵巢自体移植物中ASCS治疗的支架,发现体外与干细胞共培养可保持干细胞活力长达5 d,使促血管生成因子的缓慢持续释放达到治疗水平;体内可以促进大鼠雌孕激素恢复,且不干扰卵巢卵泡、纤维化、细胞凋亡或细胞增殖的数量和活力,提出凝胶泡沫支架作为细胞支架可能是治疗冻融卵巢自体移植物的ASC递送的一种可行且安全的非侵入性技术。干细胞分泌组包含许多分子和生长因子,分泌组的使用可能是一种新的细胞治疗方法[18]。Damous等[19]将大鼠ASCS分泌组注射至双侧自体移植冻融卵巢中,发现移植物形态学受损、卵泡数量减少和细胞凋亡增加,表明ASCS分泌组的无细胞治疗加重了对缺氧的卵巢移植物缺血损伤,提示在卵巢移植中应用分泌组要谨慎,未来需要更多的研究来评估所涉及的因素以及将分泌组应用于支架中以优化其使用的可能性。近年来,研究者们逐渐开展ASCS对异种冻融卵巢移植的研究。Manavella 等[20]将装载ASC的纤维蛋白植入物与人卵巢组织异种共移植到严重联合免疫缺陷小鼠腹膜,发现ASC可分化为人内皮细胞谱系,并增加血管内皮生长因子的基因表达,进而改善卵巢组织血流灌注;Cacciottola等[21]发现使用异种冻融卵巢移植前14 d,将装载ASCs的纤维蛋白支架移植到移植部位,可加快卵巢移植物再灌注以减轻缺氧相关反应,组织中的卵泡显示出较低水平的HIF1信号通路的激活,并通过移植后血管内皮生长因子的长期增加来维持;无论采用何种移植策略,氧化应激相关的核因子红系相关因子2及提示卵母细胞DNA损伤的8-羟基脱氧鸟苷均无显著升高,未发现氧化应激相关损伤的证据。Cacciottola 等[22]将ASCS预处理的冻融人卵巢组织移植入裸鼠,发现ASCS通过调节PI3K/Akt途径减少原始卵泡活化,并抑制Hippo通路抑制卵泡生长,最终保护原始卵泡池,对卵巢储备产生积极影响。Damous 等[23]将冻融大鼠卵巢自体移植物经ASC治疗后,发现ASC在短时间内不影响卵巢移植物形态和活力的情况下,促进了与细胞凋亡Capsase14和炎性细胞因子Cxcl6家族相关的基因的过度表达,但细胞凋亡和炎症对移植物的长期影响有待进一步研究。因此,脂肪干细胞疗法对于卵巢移植物的影响有可能是双面性的,需进行长期评估获得更全面的认知。

2.其他源性干细胞:除了MSCs在卵巢冷冻移植应用较多以外,其他源性干细胞等也可改善移植后卵泡存活。Dalman等[24]将人冷冻保存的碎片卵巢组织与源自膜腔干细胞的人膜祖细胞(hTPCs)共培养,发现卵泡显著生长,卵母细胞中卵泡生成相关基因如透明带糖蛋白(ZP1、ZP2、ZP3)和GDF9的表达、颗粒细胞中的AMH和膜细胞中骨形态发生蛋白4(BMP4)的表达均显著增高,而细胞凋亡基因(Bax、Casp3和p53)的表达显著较低,说明hTPCs在人类原始卵泡生长发育中有直接促进作用。极小胚胎样干细胞(VSELs)在女性生殖系统中在发育上等同晚期迁移的原始生殖细胞,存在于成年性腺中,可为正常或受损的卵巢[25-26]提供间质细胞来支持其功能,在肿瘤治疗中因其静止性质存留下来并再生非功能性性腺,它的存在也解释了卵巢皮质组织移植后的自然妊娠[26]。Ebrahim等[27]研究表示,对于经环磷酰胺化学消融受损的卵巢,骨髓来源的间充质干细胞联合促性腺激素治疗通过增强极小胚胎样干细胞恢复大鼠化学消融卵巢的出生后的卵子发生,VSELs产生未成熟的卵母细胞并抵抗化疗。然而有研究表明VSEL样干细胞作为潜在的原始胚胎干细胞产生的卵母细胞样细胞与精子结合迅速释放出透明带样结构,却未产生受精现象[28],且部分可自发形成类似肿瘤样结构细胞簇并参与卵巢癌表现,包括复发性卵巢癌伴腹水[29]。因此极小胚胎干细胞是干细胞促进卵泡新生的一个可能的新的研究方向,但是否能够正常受精以及致癌性还是值得进一步研究。

二、临床应用与展望

干细胞通过各种机制对卵巢冷冻移植发挥治疗作用,以上实验研究共同表明它可促进冻融卵巢血管生成、恢复卵巢功能并激活卵泡,在未来卵巢冷冻移植中有着巨大的临床应用潜力。然而,就目前的研究现状来看,干细胞想要实现临床引用,仍有许多待解决的难题。第一,干细胞具有多分化潜能,有分化成恶性肿瘤细胞的风险;并且如何检测移植组织中肿瘤细胞的存在及避免卵巢组织移植后癌细胞复发仍是临床较大的难题。尽管已有动物实验研究表明将完全缓解的白血病患者的冷冻保存卵巢皮层移植入裸鼠,20 周后未检测到明显的恶性细胞[30],但由于有引入疾病的风险,该方法的未来安全性需要开发有效的测试来检测。第二,用干细胞改善卵巢组织冷冻与移植后造成的卵泡损伤,目前仅仅评估了其对移植物早期血管生成与卵泡恢复的作用,未来的研究应评估这种治疗对移植物存活和内分泌活性的真正益处。但长期的效应仍需要继续进行实验研究获得更科学全面的认知。第三,对于干细胞新生卵泡是否可以进行正常受精并获得妊娠,仍需要进行进一步的研究确认。第四,将卵巢组织移植引入临床实践需要解决许多问题,如冻融协议的标准化、选择卵巢移植手术的时间等。目前2015年报道了在月经初潮前冷冻保存的卵巢组织进行卵巢组织自体移植后成功恢复生育能力,并实现活产,因此儿童期进行手术是可行的[31]。第五,移植技术的改进,如移植支架与组织的兼容性得到证实,2016年报道了有研究用人细胞外基质支架对先前冷冻保存的卵巢组织使用机器人辅助微创手术微创移植移植后的首次妊娠及活产[32]。近年来有研究者使用无细胞支架以接种不同类型的干细胞用于卵巢修复及更安全地促进新生卵泡[33]。因此干细胞疗法对于卵巢的影响有可能是双面性的,需要全面提高干细胞的认知并进行实验验证其对冷冻卵巢的安全性及有效性,并在未来推广至临床疾病的治疗。

干细胞疗法可以保护原始卵泡、抗凋亡、激活卵泡,促进卵巢血管生成和功能恢复,将来有可能成为癌症及卵巢早衰患者生育力保存的新选择。但该技术对卵巢冷冻与移植的安全性以及长期效应仍是未知的,并且干细胞用于卵巢组织低温保存和移植尚未在人类临床实施,将这些方法用于人类治疗还需要进一步的研究。因此探索干细胞改善卵巢组织冷冻与保存的最佳安全方案及长期效应仍是未来该领域的研究方向。