注射用头孢西丁钠有关物质测定方法的改进

王强?韩彬?王韵?杨天风?李聪颖?高燕霞

摘要：目的 改进注射用头孢西丁钠有关物质的测定方法。方法 采用苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Inertsil Ph-3色谱柱4.6 mm× 250 mm， 3 μm）；以甲酸铵缓冲液（取甲酸铵1.0 g，加水1000 mL使溶解，用甲酸调节pH值至2.7）为流动相A，乙腈为流动相B，按线性梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为254 nm。结果 头孢西丁峰与各杂质峰分离良好，头孢西丁在0.0446～13.3692 μg/mL范围内线性良好，检出限为0.89 ng，精密度与重复性均符合规定。结论 本方法灵敏度高，分离效果好，可现实对头孢西丁钠已知杂质和聚合物杂质进行同时检测。

关键词：注射用头孢西丁钠；有关物质；聚合物；方法优化；质量控制

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Improvement on the HPLC method for determination of related substances in cefoxitin sodium for injection

Abstract Objective This study improved the determination method of related substances in cefoxitin sodium for injection. Methods The column of phenyl silane-bonded silica gel as filler （Inertsil Ph-3， 4.6 mm×250 mm，3 μm） was used， and the mobile phase was composed of mobile phase A （1.0 g/L solution of ammonium formate adjusted to pH 2.7 with formic acid） and mobile phase B （acetonitrile） to carry out gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 35 ℃ and the detection wavelength was 254 nm. Results The peaks of cefoxitin sodium and its related substances were separated well. The linearity was good within the range of 0.0446～13.3692 μg/mL， and the limit of detection was 0.89 ng. Precision and repeatability met the requirements. Conclusion The method had the advantages of high sensitivity and good resolution， and could be used for the simultaneous detection of impurities and polymers.

Key words Cefoxitin sodium for injection; Related substances; Polymers; Method optimization; Quality control

頭孢西丁钠（cefoxitin sodium）属于第二代头孢菌类药物，由链霉菌产生的甲氧头孢菌素C经半合成制得，对于革兰阴性菌具有较强的抗菌作用。注射用头孢西丁钠由无菌原料直接分装制成，无辅料添加。1974年由默沙东公司（Merck Sharp&Dohme）开发上市[1]，商品名美福仙（Mefoxin），1993年进入我国市场销售。临床主要用于敏感菌所致的呼吸道感染、心内膜炎和腹膜炎等感染，最主要的不良反应为皮疹等过敏反应[2]。

注射用头孢西丁钠收载于《中国药典》2020年版[3]及美国药典USP-NF2023版[4]。有关物质项下，《中国药典》2020年版仅规定了最大单个杂质和总杂质的限度，未对已知杂质进行控制；USP中未设置有关物质检测项。头孢西丁钠属β-内酰胺类抗生素，易产生聚合物类杂质[5]，但各国药典均尚未设置聚合物类杂质检查项。对有关物质和聚合物类杂质的控制是保证抗生素类药品安全性的重要环节，也一直是当前国内外药品质量控制的热点之一[6]。本文参照欧洲药典（EP11.0）中头孢西丁钠原料有关物质HPLC检查法，通过优化色谱条件，实现了对已知杂质和聚合物类杂质的同时检测，为完善药品质量标准提供了参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本shimadzu公司），Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120质谱仪（美国Thermofisher公司），Mettler TOLEDO XS205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

头孢西丁钠对照品（批号130572-201603，95.1%）来自中国食品药品检定研究院；头孢西丁峰鉴别对照品（批号Y0001496）为欧洲药典（EP）对照品。乙腈为色谱纯（德国Merck公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 样品

选择原料分别来源于不同生产企业的3个厂家（分别以A、B、C表示） 的注射用头孢西丁钠，样本基本可涵盖目前国内的现状。

2 方法

2.1 色谱条件

2.1.1 有关物质色谱条件

色谱柱：Inertsil Ph-3（4.6 mm×250 mm，3 μm）；流动相A：甲酸铵缓冲液（取甲酸铵1.0 g，加水1000 mL使溶解，用甲酸调节pH值至2.7）；流动相B：乙腈，柱温为35 ℃；检测波长为254 nm；进样体积20 μL。按表1进行线性梯度洗脱。

2.1.2 雜质分析质谱条件

离子源：H-ESI；正离子喷雾电压：3500 V；鞘气流速：60 Arb；辅助气流速：15 Arb；吹扫气流速：2 Arb；离子传输管温度：350 ℃；气化温度：350 ℃；扫描模式：Full MS；扫描范围：100～1000 m/z。

2.2 溶液的配制

2.2.1 系统适用性溶液

取头孢西丁钠适量，精密称定，用磷酸盐缓冲液（称取磷酸二氢钾0.1 g和无水磷酸氢二钠0.18 g，加水1000 mL使溶解，用磷酸或1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0）溶解并定量稀释成每1 mL中约含0.1 g的溶液，室温放置3 d。量取适量，用磷酸盐缓冲液溶解并定量稀释成每1 mL中约含1 mg的溶液。

2.2.2 供试品溶液

取样品适量，精密称定，加磷酸盐缓冲液溶解并稀释制成约含1 mg/mL的溶液，摇匀。

2.2.3 对照溶液

精密量“2.2.2”项供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度。

2.3 方法验证

按《中国药典》2020年版通则9101分析方法验证指导原则要求进行方法的验证。

2.3.1 专属性

（1）系统适用性

取“2.2.1”项下系统适用性溶液，依法测定，考察各杂质间分离度。

（2）强制降解实验

取A厂家样品制备6份供试品溶液，分别置不同的条件进行降解试验，条件如下：①酸破坏：加0.1 mol/L盐酸溶液2 mL，室温放置5 min，再加1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL中和；②碱破坏：加0.1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，室温放置5 min，再加1 mol/L盐酸溶液2 mL中和；③氧化破坏：加3%过氧化氢2 mL，室温放置10 min；④热破坏：70 ℃水浴加热15 min；⑤光照破坏：在光照（照度为4500 Lx）下，连续照射72 h；⑥紫外破坏：紫外灯（365 nm）下6 h。

2.3.2 检出限与定量限

取头孢西丁对照品适量，加溶剂逐步稀释制备溶液，分别精密量取20 ?L ，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以信噪比（S/N）为3计算检出限，以信噪比（S/N）为10计算定量限。

2.3.3 线性范围

精密称取头孢西丁钠对照品93.72 mg，置50 mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取储备液1 mL置100 mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。分别精密量取0.05、0.25、0.5、2.5、5.0、10.0和15.0 mL置20 mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。取上述溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。

2.3.4 重复性

取B厂家样品平行制备6份供试品溶液，依法测定各杂质含量，考察方法重复性。

2.3.5 进样精密度

取“2.2.3”项下对照溶液，连续进样6次，以峰面积计算RSD，考察精密度。

2.3.6 耐用性

根据“2.1.1”项下的色谱条件，分别考察不同流动相pH值（±0.05）、柱温（±2 ℃）及不同批次色谱柱对系统适用性试验的影响。

2.3.7 溶液稳定性

取A厂家样品制备供试品溶液和对照品溶液。分别于0、4、8、10、12 h量取20 μL注入液相色谱仪（进样室温度4 ℃），记录色谱图。计算各已知杂质、总杂质的含量，以评价溶液的稳定性。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

取不同品牌、规格的色谱柱进行实验，发现Agilent Eclipse XDB-Phenyl（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB-Phenyl（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）均无法有效分离主峰与杂质I（相对主峰约0.98处），而GL sciences Inertsil Ph-3（4.6 mm×250 mm，3 μm）可实现有效分离且分离效果最佳，因此选择其作为本方法的适用色谱柱。

3.2 洗脱梯度的优化

在EP色谱条件下，结合LC-MS分析，发现色谱图中50 min后有两个聚合物杂质。相关文献表明[7-9]，RP-HPLC色谱系统更强的专属性。因而在原梯度的基础上，通过增加流动相B的比例来缩短聚合物杂质的洗脱时间，并适当增加梯度完成后的平衡时间，实现对有关物质与聚合物类杂质的同时检测。

3.3 方法验证

3.3.1 系统适用性

在系统适用性实验色谱图中，杂质A、杂质I、头孢西丁、杂质H、杂质E、杂质B、杂质J、聚合物1和聚合物2依次出峰（图1），各色谱峰的相对保留时间分别约为0.83、0.98、1.00、1.04、1.11、1.18、1.69、1.74和1.95，各色谱峰之间均可实现完全分离。

3.3.2 强制降解实验

在诸强制降解实验（酸、碱、氧化、热、光照、紫外破坏）中，头孢西丁主峰及各杂质峰的分离度均可满足要求（图2），提示本方法的专属性良好。

3.3.3 检出限与定量限

本方法的检测限为0.0446 ?g/mL（0.89 ng），定量限为0.1337 ?g/mL（2.68 ng），分别相当于供试品溶液的0.005%与0.015%，方法的灵敏度满足有关物质检测的要求。

3.3.4 线性范圍

本方法在浓度0.0446～13.3692 μg/mL范围内线性良好。线性方程为Y=25354X+765.73（r=0.9999）。

3.3.5 重复性

相同样品分别进行6次测定，杂质A结果为0.09%～0.10%（RSD 5.2%）、杂质I为0.40%～0.41%（RSD 1.0%）、杂质H为0.05%（RSD为0）、杂质E为0.11%（RSD为0），聚合物1为0.07%～0.08%（RSD 5.2%），杂质总和为1.17%～1.20%（RSD 0.9%），提示方法的重现性良好。

3.3.6 进样精密度

取对照溶液，连续进样6次，峰面积为231308～ 232419（RSD为0.2%），提示方法的精密度良好。

3.3.7 耐用性

实验中色谱条件的细微波动对主峰和各杂质虽有微小的影响，但各峰间分离度均能满足要求，主要已知杂质的相对保留时间变化较小（表2），提示方法色谱条件的耐用性可满足常规检测的需要。

3.3.8 溶液稳定性

头孢西丁钠供试品溶液在4 ℃条件下稳定，各已知杂质、杂质总和变化不大，变化范围均为0.01%。

3.4 杂质结构分析

采用LC-MS/MS对实际样品中主要杂质的结构进行推测。杂质A、杂质I、杂质H、杂质E、杂质B及杂质J的结构在EP11.0中已经明确给出，LC-MS/MS推测结果与EP给出的结构相吻合（表3）。

对聚合物1（RRT=1.74）和聚合物2（RRT=1.95）的结构进行分析（表4）。聚合物1的一级质谱图中m/z 870.1166为[M+NH4]+，分子量为852.0859，推测分子式为C32H32N6O14S4。二级质谱图中主要的裂解碎片为m/z 731.0605、m/z 671.0345、m/z 587.0857、m/z

456.9945、m/z 218.9936（图3）。聚合物2的一级质谱图中分子离子峰m/z 750.1024为[M+H]+，767.1292为[M+NH4]+，分子量为749.0954，推测分子式为C30H31N5O10S4。二级质谱图中主要的裂解碎片为m/z 712.0429、m/z 545.0053、m/z 501.0138和m/z 448.0057（图4）。

3.5 样品测定

取3个厂家的样品分别进行检测，计算杂质含量，结果表明各企业样品存在一定差异，主要为杂质I，B企业样品杂质I含量明显高于其他两家企业样品，为0.40%，样品检验结果见表5。

4 结论

本文优化的检测注射用头孢西丁钠有关物质的高效液相色谱法，具有专属性强、灵敏度高、操作简单的特点，可准确测定头孢西丁钠有关物质及聚合物类杂质。与2020版《中国药典》方法相比，改进后的方法对杂质的检出更为全面，可作为现有药品质量标准的有效补充。

参 考 文 献

尹伟成， 彭东明， 周汨， 等. 头孢西丁钠的合成工艺改进[J]. 中国新药杂志， 2014， 23（24）： 2930-2934.

吴继霞. 注射用头孢西丁钠的不良反应分析[J]. 中国继续医学教育， 2015， 7（25）： 178-179.

国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. （2020年版二部）. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 305.

The United States Pharmacopoeia NF2023[S]. https：//doi.org/10.31003/USPNF_M14107_03_01.

胡昌勤. β-内酰胺类抗生素聚合物杂质控制策略的形成与发展[J]. 中国抗生素杂志， 2020， 29（11）： 1231-1244.

胡昌勤， 张夏. 化学药品杂质谱控制的现状与展望[J]. 药学学报， 2019， 54（12）： 2214-2231.

李进， 姚尚辰， 尹利辉， 等. 注射用头孢西丁钠的聚合物杂质分析[J]. 中国新药杂志， 2021， 30（11）： 1038-1047.

黄财顺， 陆璐璐， 贺凡珍， 等. β-内酰胺类抗生素聚合物检测中的质控方法分析探讨[J]. 化工与医药工程， 2022， 43（3）： 20-24.

李金彦， 李兰涛. 色谱法测定β-内酰胺类抗生素中聚合物的研究进展[J]. 精细化工中间体， 2022， 52（2）： 5-8.