头孢克洛聚合物杂质的分析

张丹丹?赵浩然?刘文坤?李宁宁?常笑?陈德俊

摘要：目的 对头孢克洛中聚合物杂质的结构进行初步鉴定，对其产生机理进行初步分析。方法 以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 8.0）为溶剂，室温放置4 d，制备头孢克洛强制聚合溶液；采用HPSEC法对强制聚合物溶液中各杂质进行分离，结合二维液相脱盐技术、柱切换-LC/MSn技术，根据各杂质一级、二级精确质量信息及聚合机制，初步鉴定主峰前各杂质结构。结果 对头孢克洛强制聚合溶液中的9个聚合物杂质结构进行初步解析，并初步分析其产生机理。结论 强制聚合溶液可作为头孢克洛原料及制剂中聚合物杂质研究分析用系统适用性溶液。本研究中推测的聚合物杂质结构对头孢克洛原料及其制剂的杂质谱研究及质量控制有重要参考意义。

关键词：头孢克洛；聚合物杂质；化学结构；柱切换-LC/MSn；二维液相色谱

中图分类号：R978.1，R917文献标志码：A

Analysis of polymer impurities of cefaclor

Abstract Objective To identify the structures of polymer impurities in cefaclor raw materials. And the mechanisms of their production were analyzed. Methods The cefaclor forced-polymerization solution was prepared with 0.05 mol/L phosphate buffer （pH8.0） at room temperature for 4 days. The impurities in the forced-polymerization solution were separated by HPSEC method， and the structures of the impurities before the main peak were identified according to the primary and secondary precise mass information and the polymerization mechanism， combined with two-dimensional liquid desalination technology and column switching LC/MSn technology. Results Preliminary elucidation was conducted on 9 polymer impurity structures present in the cefaclor forced-polymerization solution. Concurrently， an examination was conducted on their mechanisms of production. Conclusions The cefaclor forced-polymerization solution can be used as suitable solution for the study and analysis of polymer impurities in cefaclor. The predicted polymer impurity structures in this study have important reference significance for the impurity profile study and quality control of cefaclor raw materials and their preparations.

Key words Cefaclor; Polymer impurities; Chemical structure; Column switch-LC/MSn; 2D-HPLC

β-內酰胺类抗生素是临床广泛使用的抗菌药物，其原料与制剂在生产、运输、存储过程中易产生聚合物杂质[1]。β-内酰胺类抗生素中的聚合物杂质容易引发过敏反应甚至过敏性休克反应，但却是其杂质谱控制中相对薄弱的环节[1-2]。随着分析技术的进步，对β-内酰胺类抗生素中聚合物的认知也不断深入[3-5]。

头孢克洛（cefaclor）为第二代半合成头孢菌素，最早由美国礼来制药公司成功研制。其作用机制是通过与细菌的青霉素结合蛋白相结合，进而抑制细菌细胞壁的合成，临床适用于敏感菌所致泌尿系统、呼吸系统、皮肤软组织感染等[6-7]。头孢克洛化学结构式见图1，其C7位侧链上有自由氨基，易于与另一分子β-内酰胺环聚合，从而生成头孢克洛聚合物杂质。

目前，国内外药典对头孢克洛中的聚合物杂质均未予以控制。虽有文献采用Sephadex G-10凝胶色谱柱[8]及TSKgel G2000SWxl色谱柱法[9-10]对头孢克洛制剂中的聚合杂质进行测定，但是对头孢克洛聚合物杂质的结构研究却鲜有报道。本文采用二维液相色谱法结合柱切换-LC/MSn法对头孢克洛原料中的聚合物杂质进行分析，结合头孢克洛结构性质、杂质的质谱信息及聚合机制，推测聚合物杂质的结构并探讨其可能来源。

1 材料与方法

1.1 仪器

MS105DU型电子天平，Thermo Q-Exactive plus二维高效液相色谱-质谱联用仪（配有双三元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、变色龙软件、Q-Exactive plus质谱检测器、Mass frontier7.0软件）。

1.2 样品与试剂

头孢克洛原料药（生产厂家：齐鲁安替制药有限公司）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠（分析纯；国药集团化学试剂公司）；磷酸（分析纯；天津科密欧化学试剂有限公司）；乙酸铵、乙腈（色谱纯；Fisher Scientific）；去离子水为屈臣氏瓶装纯净水。

1.3 高效凝胶排阻色谱（HPSEC）方法

色谱柱：TSK-gel G2000 SWxl（填料：球状亲水硅胶，300 mm×7.8 mm，5 μm）；流动相：磷酸盐缓冲液[0.005 mol/L磷酸氢二钠溶液-0.005 mol/L磷酸二氢钠溶液（61：39）]- 乙腈（94：6）；检测器：263 nm；流速：0.5 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：20 μL；用于HPSEC法分离头孢克洛中聚合物杂质。

1.4 柱切换-LC-MS法

1.4.1 一维色谱系统

方法同“1.3”高效凝胶排阻色谱（HPSEC）方法，进样体积增加至40 μL。

1.4.2 二维色谱系统

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD（C18，

2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相A：5 mmol/L醋酸铵溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱：0～（t+6） min （t为目标杂质在一维色谱系统的保留时间），5%B；（t+6）→（t+21） min，5%～95%B；（t+21）→（t+26） min，95%B；（t+22）→（t+27）min，5%B。切换阀：六通阀；切换用定量环体积：500 μL。用于对一维色谱系统分离的聚合物杂质进行脱盐处理及质谱定性研究。

1.4.3 质谱条件

离子源：ESI；扫描电压：3.8 kV；毛细管温度： 320 ℃；鞘气流速：40 mL/min；辅助气流速：10 mL/min；一级质谱方法：正离子模式，分辨率70000，扫描范围m/z 100～1500；二级质谱方法：分辨率17500，NCE：10，20，30。

1.5 强制聚合溶液配制

0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）：0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（61：39），并用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0。

强制聚合溶液：精密称取头孢克洛约140 mg，置10 mL量瓶中，加0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）制成约含头孢克洛14 mg/mL的溶液。室温条件下避光放置4 d，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

2 结果

2.1 HPSEC法分析头孢克洛原料中聚合物杂质

参照《中国药典》2020年版头孢地嗪钠[11]有关物质Ⅱ检查方法及文献[9]，进行色谱条件的优化。建立的HPSEC法分析头孢克洛强制聚合溶液，在头孢克洛主峰之前分离出6个弱保留值杂质（图2），即杂质1～6。

2.2 柱切换-LC/MS法推测头孢克洛聚合物的化学结构

采用在线柱切换-LC/MS法将杂质1～6分别切入至定量环中，经脱盐处理后，进行质谱分析。结果显示，杂质5峰中包括4个共流出杂质峰，其他5个杂质峰中分别含有1个杂质峰。结合头孢克洛结构性质、杂质的质谱信息及聚合机制，推断质谱中分析出的9个杂质结构及来源，初步可推定其中6个聚合物杂质的结构，其他3个杂质结构及来源有待进一步研究。

2.2.1 已推定的聚合物杂质

杂质2经柱切换进入质谱后，可检出杂质2-a（图3A）。在杂质2-a的全扫描一级质谱图中存在m/z 1397.21、m/z 1419.19的准分子离子峰，为[M+H]+、[M+Na]+峰，推测杂质2-a的分子量为1396 Da（图3B）；其二级质谱图中存在m/z 699.11的分子离子峰，应为聚合物杂质2-a的单体加氢离子（图3B）；其可能结构及来源见图3C。初步推测其聚合反应过程：头孢克洛C-3位水解成羟基后，与另一分子头孢克洛通过酰胺化聚合生成聚合物1或聚合物2；聚合物1、聚合物2的自身再聚合以及聚合物1和聚合物2之间的再聚合均可生成杂质2-a。聚合位点主要包括头孢克洛、头孢克洛C-3水解物7位侧链的游离氨基和四元内酰胺环，理论上可形成多种异构体。

将杂质5切换至质谱可以检出4个共流出的杂质峰（杂质5-a，杂质5-b，杂质5-c，杂质5-d）（图4）。在杂质5-a的全扫描一级质谱图中存在m/z 699.15准分子离子峰（[M+H]+）；其二级质谱图中存在m/z 350.08的分子离子峰，应为聚合物杂质5-a的单体加氢离子；即杂质5-a的分子量应为698 Da。在其二级质谱图中，存在羟基脱水碎片m/z 681.14 （m/z 699-18），脱羧基碎片m/z 655.12（m/z 699-44）。初步推测，此聚合物雜质系由头孢克洛C-3位水解后自身聚合而成。其可能结构及来源见图5A。

在杂质5-b的全扫描一级质谱图中存在m/z

663.13、m/z 685.11的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+峰；其二级质谱图中存在

m/z 332.07的分子离子峰，应为聚合物杂质5-a的单体加氢离子；推测杂质5-b的分子量为662 Da。在其二级质谱图中，脱羧基碎片m/z 619.15（m/z 663-44）。初步推测，头孢克洛水解后经分子内酰胺化生成哌嗪类衍生物（即中间体1），再经分子内重排、脱水，生成吡嗪类衍生物（即中间体2），中间体2与其C-3位水解物（即中间体3）发生酰胺化反应生成杂质5-b。其结构及来源分析见图5B。

在杂质5-c的全扫描一级质谱图中存在

m/z 699.15、m/z 716.18的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+NH4]+峰；且其二级质谱图中存在m/z 350.08的分子离子峰，应为聚合物杂质5-c的单体加氢离子。即杂质5-c的分子量应为698 Da，初步推测其为聚合物杂质5-a的差向异构体。

在杂质5-d的全扫描一级质谱图中存在m/z

735.09、m/z 757.07的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+峰；其二级质谱图中存在

m/z 368.05的分子离子峰，应为聚合物杂质5-d的单体加氢离子。即杂质5-d的分子量为734 Da，推测其应为头孢克洛二聚物或头孢克洛差向异构体二聚物，其结构及来源分析见图5C。

将杂质6经柱切换进入质谱后可检出杂质6-a（图6）。在杂质6-a的全扫描一级质谱图中存在m/z735.09、m/z 757.07的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+峰；其二级质谱图中存在m/z 368.05的分子离子峰，应为聚合物杂质6-a的单体加氢离子。即杂质6-a的分子量应为734 Da，与杂质5-d分子量相同。推测其为头孢克洛二聚物或头孢克洛差向异构体二聚物。

2.2.2 有待进一步研究的杂质

将杂质1经柱切换进入质谱后，可检出杂质1-a（图7A）。在杂质1-a的全扫描一级质谱图中存在m/z 1030.17、m/z 1052.15的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+峰，推测杂质1-a的分子量为1029 Da。1032峰、1034峰为1030峰的氯同位素峰， 1030峰、1032峰、1034峰丰度比为9：6：1，表示分子内含2个氯原子。但其具体结构有待进一步研究。

将杂质3经柱切换进入质谱后，可检出杂质3-a（图7B）。在杂质3-a的全扫描一级质谱图中存在m/z 935.12准分子离子峰[M+H]+；其二级质谱图中存在m/z 468.06的分子离子峰，应为聚合物杂质3-a的单体加氢离子。初步推测杂质3-a的分子量为934 Da，可能为头孢克洛二聚体衍生物，其结构有待进一步研究。

将杂质4经柱切换进入质谱，可分析检出杂质4-a（图7C）。在杂质4-a的全扫描一级质谱图中存在

m/z 879.13、 m/z 901.11的准分子离子峰，为[M+H]+、

[M+Na]+峰；其二级质谱图中存在m/z 440.07的分子离子峰，应为聚合物杂质4-a的单体加氢离子。初步推测杂质4-a的分子量应为878 Da，可能为头孢克洛二聚体衍生物，其结构有待进一步研究。

3 讨论

由头孢克洛的分子结构可知，其聚合反应途径主要为C-7位侧链的伯氨基与另一分子母核四元内酰胺环的羰基的反应[2]。本研究对头孢克洛聚合物杂质的LC-MS分析揭示，其主要为头孢克洛或头孢克洛水解物按上述机理反应形成的二聚体或多聚体，与C-7位含有相似侧链结构的头孢氨苄、头孢拉定等的聚合反应途径相似。但由于头孢克洛C-3位的氯基团较易水解成羟基，其水解物可能发生分子内酰胺化生成哌嗪类衍生物，再经分子内重排、脱水，生成吡嗪类衍生物参与聚合反应，又使得其与头孢拉定、头孢氨苄的聚合反应途径的不同，表现出一定的复杂性，这可能是出现多个尚待进一步研究的杂质的原因。

本研究制备了头孢克洛强制聚合反应溶液，采用HPSEC法进行分析，同时结合2D-HPLC、柱切换-LC/MS现代色谱分析技术，对头孢克洛的聚合物杂质结构进行研究。结合头孢克洛结构性质、杂质的质谱信息及头孢菌素的聚合反应机制，对头孢克洛聚合物杂质进行结构解析，并初步推测了其产生机制，为后续头孢克洛聚合物的研究及抗生素中聚合物杂质的形成机理研究提供了参考。同时，对头孢克洛原料及制剂的杂质谱研究、质量控制具有重要参考意义。

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