基于Wnt/β-catenin信号通路干预糖尿病足创面愈合的中药研究进展

杨宁，王艺晨，丁选胜

（中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏 南京 211198）

糖尿病足（diabetic foot，DF）是糖尿病患者最严重的并发症之一，是糖尿病所致的足部溃疡或肢端坏疽，常伴有感染。根据相关流行病学数据显示，全球DF成人患者的足溃疡患病率平均为6.3%，3 ～ 5年复发率为65%，终生下肢截肢发生率约为20%，5年死亡率高达50% ～ 70%[1]。因DF具有易复发、高致残率和高死亡率等特点，导致DF的临床治疗颇具挑战。

目前普遍认为，持续性高血糖引起的糖尿病神经病变和血管病变是DF的主要病因，进一步的细菌感染加剧了DF的治疗难度，创面久治不愈[2-3]。针对DF创面的药物治疗，在内科管理的基础上，西医常采取口服扩血管药物、抗凝药物、镇痛药等改善下肢血液供应或神经疼痛，但因药物毒性、成瘾性等较多不良反应导致临床治疗困难[4]。近年来，中医药在促进DF创面愈合方面具有标本兼治、辨证论治、安全低毒等鲜明优势，表现出较好的临床效果。DF属中医“筋疽”“脱疽”范畴，虚实夹杂，是湿、热、毒、虚等因素共同作用的结果[5]。我国DF防治指南[6]推荐，根据中医辨证分型或创面愈合不同分期可采用中药熏洗外敷、口服中成药或复方汤剂等，以清化湿毒、温通经脉、活血化瘀。Wnt/β-catenin信号通路在调节细胞生长、组织修复、器官发育等方面至关重要。此外，中药基于Wnt/β-catenin信号通路干预DF创面愈合的研究逐年增多。本文对近年来基于Wnt/β-catenin通路调控DF创面愈合的中药及中药活性成分研究进展进行综述，以期为DF的新药研发及临床治疗提供参考。

1 Wnt/β-catenin信号通路的组成及调控

Wnt基因发现于小鼠乳腺癌的整合酶1（integration 1，Int1）和果蝇的无翅（wingless，Wg）基因，由于这2个基因的结构和蛋白功能相似，故将其组合命名为Wnt基因[7-8]。Wnt信号通路包含经典信号通路（Wnt/β-catenin）和非经典信号通路，两种主要通路形成相互调控的网络，参与哺乳动物某些组织的自我更新与修复[9-10]。Wnt配体是分泌性糖蛋白，结合膜上的卷曲受体蛋白（frizzled，FZD）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related proteins 5/6，LRP5/6），启动诱导信号；β-连环蛋白（β-catenin）是具有调节细胞间黏附及基因转录的双功能蛋白，受Wnt信号诱导后入核，参与下游信号传导[11]。经典的Wnt途径是高度保守的，当无Wnt时，胞质中结肠腺瘤样息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）与支架蛋白轴蛋白（axis inhibitor，Axin）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）以及糖原合酶激酶-3β蛋白（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）共同组成“破坏复合体”，捕获并降解β-catenin蛋白；当Wnt存在时，其被跨膜受体FZD和LRP5/6识别，“破坏复合体”被招募至细胞膜上，与FZD相互作用，失去了对β-catenin的降解能力。诱导的β-catenin可易位至细胞核，并激活核转录因子——T细胞因子（T cell factor，TCF）和淋巴样增强结合因子（lymphoid enhancer binding factor，LEF），从而启动下游细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、c-Myc、TCF1、Axin2等靶基因的转录，介导细胞增殖、迁移和分化相关基因的表达[12]。

2 Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病足创面愈合中的作用

正常的创面愈合主要包括止血、炎症、增殖和重塑4个阶段[13]。与正常愈合过程相比，DF的创面愈合多表现为炎症阶段的时间延长、细胞增殖受限和组织重塑失衡，伴随众多关键结构蛋白和调节因子失调[14]。大量研究表明，Wnt/β-catenin信号通路是调节伤口愈合、血管新生、上皮重塑、维持干细胞多能性的关键通路之一[15]。相关研究也阐述了Wnt/β-catenin信号通路的部分效应蛋白可通过调节葡萄糖稳态、胰岛β细胞增殖直接参与1型糖尿病或2型糖尿病发生发展[16]。检测糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）患者创面肉芽组织的β-catenin与GSK-3β的表达结果显示，DFU患者Wagner分级越高，创面组织中β-catenin表达水平越低，GSK-3β表达水平越高，Wnt/β-catenin信号通路功能越差；Spearman相关性分析进一步提示，激活Wnt/β-catenin信号通路可能对DFU创面愈合产生积极影响[17]。

2.1 Wnt/β-catenin信号通路调节炎症

伤口愈合早期，适度的炎症反应有助于机体清除病原体，但在糖尿病创面愈合中，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）累积，阻碍了中性粒细胞对细菌及细胞碎片的吞噬能力，同时大量单核细胞募集并向巨噬细胞转化，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6等促炎细胞因子过度释放，导致持续的炎症反应，继而损害后续的增殖及组织再上皮化[18]。巨噬细胞（macrophage，Mp）是创面愈合中Wnt配体的重要来源，而巨噬细胞功能障碍又是启动炎症反应的主要因素[19]。研究表明，慢性伤口周围约80%的细胞是促炎的M1巨噬细胞，M1与抗炎的M2巨噬细胞稳态被打破，因此通过Wnt调节M1/M2巨噬细胞比例平衡是促进伤口愈合的策略之一[20-21]。另一项实验研究显示，糖尿病创面形成21天后，即创面愈合的中后期，糖尿病创面较正常创面组织中IL-6和TNF-α水平显著升高（P＜0.01），Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表达明显降低（P＜0.01），说明炎症反应可能贯穿糖尿病创面愈合的整个阶段，且对Wnt/β-catenin通路的抑制介导了这一过程[22]。

2.2 Wnt/β-catenin信号通路调节血管新生

不管是神经性DF还是缺血性DF，内皮功能障碍均是创面难愈的共同分子机制[23]。内皮细胞是维持血管张力与物质代谢稳态的必要细胞基础。持续性高血糖损害内皮屏障，血管活性物质的释放减少，从而阻碍创面的血液流动及血管新生。Wnt/β-catenin信号转导与血管重塑关系密切，该通路不仅调节内皮细胞的血管生成活性，还能促进多能干细胞向血管内皮细胞的分化[24-25]。另一方面，巨噬细胞可以分泌Wnt5a、Wnt7b等蛋白，直接或间接地促进糖尿病患者伤口的血管重塑[26-27]；体外实验也表明，Wnt9b/β-catenin信号受到抑制时，人血管内皮细胞的增殖和成管能力明显降低，细胞凋亡进程加快，阻碍了伤口的愈合[27]。

2.3 Wnt/β-catenin信号通路调节细胞增殖与组织重塑

角质形成细胞与成纤维细胞在增殖阶段发挥重要作用，它们的募集和活化是细胞增殖阶段的重要特征。在难愈性糖尿病创面中，这2种细胞的增殖及迁移被抑制，分泌的生长因子减少，细胞间紧密连接受损；另一方面，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）增多会破坏细胞外基质屏障，减缓了创面的再上皮化[28-29]。在促进DF创面愈合中，受损的神经细胞会进行再生和重塑；体外神经干细胞研究表明，Wnt3a信号的激活增加了β-catenin的蓄积和入核，促进靶基因Cyclin D1的转录，与细胞的增殖与分化呈正相关[26]。糖尿病创面组织病理学研究结果也显示，在伤口愈合后期，促进创面组织Wnt/β-catenin正性调控因子的表达，抑制GSK-3β负性调控因子水平，可以明显促进肉芽组织的增生及再上皮化[30]，提示Wnt/β-catenin信号转导在创面愈合后期的重要性。

2.4 Wnt/β-catenin信号通路调节细胞凋亡

Wnt/β-catenin信号转导与细胞凋亡的关系目前尚存争议。部分研究表明，激活Wnt/β-catenin通路可以改善细胞凋亡，如抑制肾损伤疾病中肾小管上皮凋亡[31]，减缓生殖疾病中颗粒细胞凋亡[32]，可对抗疾病发展；然而在大多数癌症中，Wnt/β-catenin通路的激活是肿瘤细胞的自我防御，从而促进肿瘤的转移及生长[33-34]。在糖尿病创面愈合中，现有研究的结论相对一致，高糖可以抑制Wnt等蛋白表达，阻碍β-catenin及下游靶基因的转录，从而使得抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）表达水平下降，促凋亡蛋白如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase 3）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）表达增加，引起细胞的增殖、迁移和分化受损，导致内皮功能障碍，促进凋亡进程[35-36]。对DF患者创面组织检测结果显示，Wnt1和β-catenin与血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、Bcl-2的表达呈正相关，与TNF-α、IL-6、Caspase-3 、Bax呈负相关；GSK-3β与之关系则相反[37]。上述研究结果表明，DF创面中Wnt/β-catenin通路受到抑制，激活Wnt/β-catenin信号转导，可能是抑制功能细胞凋亡的有效途径。

3 干预Wnt/β-catenin信号通路改善糖尿病足创面愈合的相关中药

已有实验及临床研究表明，许多中药复方及中药活性成分可有效改善DF创面愈合。下文就干预Wnt/β-catenin信号通路改善DF创面愈合的中药复方、中成药及中药单体研究进展进行总结。

3.1 中药复方

3.1.1 四妙勇安汤四妙勇安汤为传统经典名方，首见于《华佗神医秘传》，后收录于《验方新编》中，该方由金银花、玄参、当归、甘草4味中药组成。四妙勇安汤是我国糖尿病足防治指南推荐用药，具有调节血脂、改善神经传导速度阻滞与局部缺血等临床症状，加快创面愈合的治疗效果[38-39]。为探讨四妙勇安汤的可能作用机制，赵亚男等[40]构建2型糖尿病溃疡大鼠模型，结果发现模型组大鼠较正常组创面愈合明显延迟；创面组织的蛋白及基因水平检测结果显示，β-catenin含量明显降低，GSK-3β含量明显升高（P＜0.05）；给予四妙勇安汤干预，可缓解Wnt/β-catenin通路的抑制状态，从而促进溃疡创面愈合；动态评估不同时间点的创面病理变化及蛋白水平发现，四妙勇安汤多影响创面愈合早期的炎症阶段。

3.1.2 愈疡灵软膏愈疡灵软膏由紫草、地骨皮、当归、血竭、象皮粉、黄柏等多味中药组成，具有凉血散瘀、敛疮生肌的功效。考虑DF创面属“血热血瘀”之证，相关动物实验便引申探讨了愈疡灵软膏对DF大鼠溃疡愈合的作用及机制，结果显示愈疡灵软膏可有效改善DF大鼠溃疡创面的病理损伤[41]；与四妙勇安汤干预的起效时间对比研究发现，愈疡灵软膏也可调控Wnt信号通路，但主要在DF创面愈合的后期，即增殖与重塑阶段发挥促愈合作用[42]。内服及外用是DF疾病管理的重要手段，愈疡灵软膏外用联合四妙勇安汤内服的实验结果表明，联合给药组均优于单独给药组，提示在DF的治疗中应内治外治并重[42]。

3.1.3 如意黄金散如意黄金散首载于明代《外科正宗》，具有清热排毒、活血止痛的功效。如意黄金散现临床用于治疗静脉炎、肛周脓肿等多种疾病，如对于肛周脓肿总有效率可达95%，能明显缩短伤口愈合时间[43]。前期临床研究表明，如意黄金散能明显提高DF患者的溃疡治愈率[44]；最新的实验研究表明，如意黄金散在体外可剂量依赖性地增强成纤维细胞的抗氧化、抗炎、增殖和迁移能力；在体内升高细胞生长因子水平，增加血管和胶原蛋白的生成，其分子机制与激活Wnt信号通路有关，从而加速伤口愈合进程[45]。

1928年的《中国教育辞典》：“教育的定义有广义、侠义两种。广义说，凡足以影响人类身心之种种活动，都可以叫教育；狭义上说，用一定的方法实现之改善目的者，可称为‘教育’。”1930年的《教育大辞书》：“广而言之，凡足以感化身心之影响，俱得云教育，只称其结果，不计其方法；狭而言之，则惟具有目的，出以一定方案者，始云教育。”1985年的《中国大百科全书·教育》：“从广义上说，凡是增进人们的知识和技能，影响人们的思想品德的活动，都是教育；狭义的教育主要指学校教育，其含义是教育者根据一定社会或阶级的要求，有目的、有计划地对受教育者地身心施加影响，把他们培养成为一定社会阶级所需要的人的活动。”

3.1.4 拔毒生肌散拔毒生肌散由黄丹、红粉、轻粉、制甘石、冰片等8味药研磨而成，全方配伍，主攻拔毒生肌，兼能清热祛腐。相关专家共识推荐拔毒生肌散可广泛运用于多种慢性难愈性创面，如DF，且临床疗效及安全性良好[46]。DF的始发因素之一是AGE在组织中的积累，王双勋等[47]研究发现，拔毒生肌散可降低大鼠溃疡组织中AGE沉积和晚期糖基化终末产物受体（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）表达，且改善下游Wnt/β-catenin通路的抑制，促进糖尿病溃疡创面愈合。

3.1.5 回阳生肌膏回阳生肌膏是北京中医院用于治疗慢性皮肤溃疡阴疮的院内方剂，能有效降低局部炎症反应，抑菌杀菌，促进血管新生[48]。一项对DF大鼠溃疡阴证创面的干预研究显示，回阳生肌膏给药第14天时，创面愈合率可达到83.26%，较模型组创面愈合率明显提高，且Wnt/β-catenin信号通路的激活是其分子作用机制之一。

3.1.6 紫朱软膏紫朱软膏是柳国斌团队基于中医“煨脓长肉”理论及奚九一教授的“捞底膏”，创制的特色药膏，方中以紫草和朱砂为君药祛腐生肌，阿胶、龙血竭、黄芪为臣药以补气敛疮，佐为冰片以清热止痛，发挥促愈功效[49]。紫朱软膏系列的研究成果表明，该方可应用于糖尿病性溃疡愈合的整个阶段，改善 “热”“瘀”“虚”等病理病征，具有较好的临床疗效[50]。Wnt/β-catenin通路的激活是紫朱软膏治疗DF的作用机制之一。一项纳入60例DFU患者的临床研究报道，紫朱软膏治疗后能明显改善DFU患者溃疡组织中β-catenin、c-Myc、RSPO3等基因的转录水平低下，并降低GSK-3β基因的表达（P＜0.05）[51]。

3.1.7 畲药十二时辰复方十二时辰是闽东地区畲族常用的特色中草药，被广泛用于风湿骨痛、跌打损伤；三叶青又名金线吊葫芦，临床外治常用于蜂窝织炎。刘思延[52]将十二时辰与三叶青两药配伍，研究畲药十二时辰复方对DFU创面愈合的作用及机制，动物实验结果表明，模型组创面愈合平均周期约14天，创面组织的新生血管数量减少，肉芽增生缓慢，畲药十二时辰复方给药能明显缩短愈合时间，改善相关病理变化；同时，该研究结果表明，与正常组相比，DFU模型大鼠创面组织中β-catenin 蛋白表达明显降低，GSK-3β蛋白含量则进一步积累，再次证实了Wnt/β-catenin信号通路功能低下与DFU愈合发展的相关性。由于该复方是研究人员的初步组方探索，所以对于畲药十二时辰复方改善DF创面愈合的疗效及机制有待进一步基础及临床研究。

3.1.8 愈溃油中药油剂愈溃油，由西红花、核桃仁、全墨鱼干和菜籽油组成，具有流通气血、防止毒邪内陷、透脓并托毒外泄等功效。郝治等[53]对该油剂与糖尿病皮肤溃疡的Wnt/β-catenin信号通路关系进行探究发现，经愈溃油油剂处理9天和16天后，均可以显著提高创面愈合率、改善创面病理变化，减轻炎症反应；分子机制研究表明，糖尿病抑制了创面组织中血管新生与成纤维细胞活化的标志蛋白水平，愈溃油给药后激活Wnt信号通路，缓解了α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、血管假性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）及Wnt、β-catenin的降低，进而促进了内皮细胞和平滑肌细胞的形成与分化。

3.2 中成药

黄芪注射液是传统中药黄芪的灭菌溶液制剂。黄芪是补气活血的代表药物，早在《神农本草经》《本草汇言》等中已被记载，其具有通畅血脉，排脓止痛，敛收久溃痈疽等众多功效。黄芪注射液在临床应用于DF干预时，可通过改善患者的神经与血管功能，促进创面肉芽再生与上皮化等发挥较好的治疗效果[54-55]；相关动物实验研究表明，黄芪注射液经灌胃给药后可活化Wnt/β-catenin信号通路，显著促进糖尿病大鼠创面表皮干细胞的增殖与分化，从而有效缩短创面愈合时间，且该作用具有一定的量效关系[56]。

3.3 中药单体

3.3.2 黄芪多糖黄芪多糖是黄芪的主要药效成分，黄芪多糖作为一种多靶点生物活性物质，已被证实可以促进糖尿病性溃疡愈合[61]。相关实验研究也表明，在1型糖尿病皮肤溃疡大鼠模型中，灌胃黄芪多糖200 mg · kg-1可调节大鼠伤口愈合阶段炎症因子水平，促进血管新生、组织重塑，缩短创面愈合时间[62]。同样，以黄芪多糖、黄芪皂苷为主要成分的黄芪提取液能有效促进糖尿病创面表皮干细胞的增殖与分化，从而促进创面修复与再生，并受Wnt/β-catenin的调控[63]。环黄芪醇为黄芪的另一活性单体成分黄芪甲苷的皂苷元，具有良好的生物利用度，体外研究显示，环黄芪醇可促进表皮干细胞的增殖和迁移，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进糖尿病性创面愈合[64]。此外，黄芪及其活性成分基于Wnt/β-catenin信号通路还介导了抑制细胞凋亡、改善MMPs分泌等过程[65]。

3.3.3 芦荟多糖芦荟多糖是芦荟凝胶中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病及伤口修复等多种药理作用[66]。DFU创面的内皮细胞受损，迁移修复所需的生长因子水平降低，经芦荟多糖干预糖尿病大鼠溃疡创面后，能增加血清碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子-BB水平，同时调节Wnt/β-catenin表达以促进伤口愈合[67]。

4 结语与展望

寻求DFU愈合的有效治疗药物与作用靶点一直是临床关注的热点[68]。多项研究发现，Wnt/β-catenin信号转导调控DF创面愈合的各个阶段，尤其在调节炎症、促进血管新生方面发挥重要的作用。上述四妙勇安汤、如意黄金散、拔毒生肌散是传统中药名方，愈疡灵软膏、回阳生肌膏、紫朱软膏等是院内经验方，此外黄芪注射液、积雪草苷、黄芪多糖及芦荟多糖等，均能改善糖尿病创面中Wnt/β-catenin信号转导的抑制或失衡，从而促进DF的创面修复。关于调控Wnt/β-catenin信号通路改善DF创面愈合的中药研究虽取得了一些进展，但仍存在一些不足，主要表现在：1）调控Wnt/β-catenin信号通路改善DF的中药复方研究偏多，中成药及单体研究较少，中药活性成分的研究还处于基础实验阶段；2）基于Wnt/β-catenin信号通路的分子机制研究普遍尚不深入，实验设计重在体内药效学观察，药代动力学、毒理及体外细胞实验评价较少；3）DF不同分型发病机制不同，实验模型多未区分与比较DF分型及药物在不同分型中的作用特点，且足溃疡造模方法各异，缺乏评价标准；4）中药成分多，作用靶点和途径复杂，各成分之间的相互作用鲜少阐明，各通路之间的协同、拮抗作用有待进一步探究。因此，未来可针对上述几方面进一步研究，有望为DF防治的新靶点及药物开发提供科学依据。