基于GC-IMS 分析新疆不同寄主肉苁蓉挥发性物质

2024-04-30 12:02彭旭阳陈君然崔瀚元胡立武张子迪朱星宇陈存坤

食品工业科技 2024年9期

彭旭阳，陈君然，崔瀚元，胡立武，张子迪，朱星宇，陈存坤

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.天津市农业科学院农产品保鲜与加工与技术研究所，天津 300000；3.新疆优产农业科技发展有限公司，新疆和田 848300；4.天津天狮学院，天津 301700）

肉苁蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma.）列当科属高大草本植物，主要分布于中国的内蒙古阿拉善、新疆和田、宁夏和甘肃昌马等干燥地区[1]。肉苁蓉是稀有而珍贵中药材，有补肾阳，益精血，润肠通便，大补壮阳等功能，被誉为“沙漠人参”[2]。2018 年肉苁蓉被收录于“药食两用”目录[3]，现代药理学证明其富含多种生物活性物质，具有包括抗氧化、抗衰老、缓解疲劳、增强记忆力、保护神经、预防骨质疏松等功效[4-5]。肉苁蓉是一种全寄生植物根部，寄主有梭梭树和红柳灌木林，品质差异较大，‘红柳’肉苁蓉茎深，质地柔软表面光滑，横切面为暗红色，味略苦。‘梭梭’肉苁蓉抗旱性能较好，横截面有不规则纹路，味甘甜[6-7]。

目前对肉苁蓉的研究重点主要集中在种植技术[8]、抗氧化活性[9]、生物活性成分[10]等方面。然而，伴随市场需求的不断增加，肉苁蓉产品的质量参差不齐，甚至存在伪造现象，这给监管部门带来了极大的挑战。目前，鉴别不同肉苁蓉药材仍然面临相当大的困难，因此需要一种高效、快速、直观的分析鉴别方法来解决这一问题。

气味扫描仪（电子鼻）、气相色谱-质谱联用（GCMS）是目前分析挥发性物质常用的技术手段，但是在分析过程中需要对原材料进行加热、蒸馏、萃取等操作，过程繁琐，且过长的分析时间和过高的进样温度容易造成不稳定挥发性物质的结构改变[11-14]。气相离子迁移色谱（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）是一门新兴挥发性物质分析技术，其具有分离高效、操作简便、灵敏度高、维护成本低等优势。GC-IMS 通过顶空进样分析样品的特征成分，最大程度保留样品的气味，并通过谱图中的信号积分实现风味物质的可视化，该方法具有直观稳定、操作便捷等优势。近年来被广泛用于中药[15-17]、果蔬[18-20]、调味品[14,21]、酒产品[22-24]、添加剂[25]、香精香料[26-28]等方面。而在中药材料鉴别领域，郭凤柳等[29]通过GC-IMS 对川贝母以及其他贝母进行了鉴别，为川贝母的快速鉴别提供全新思路及技术支持。严爱娟等[30]通过GC-IMS 技术分析，比较了覆盆子和可能混淆的山莓之间挥发性特异气味成分的差异，为覆盆子和山莓的鉴别提供了新的方法和手段。而对肉苁蓉挥发性成分相关研究较少。基于此，本研究采用GC-IMS 对‘梭梭’和‘红柳’寄主肉苁蓉的挥发性成分进行了分析，探讨两种不同寄主肉苁蓉挥发性成分间的差异，将为新疆肉苁蓉挥发性成分分析及品种鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肉苁蓉新疆和田地区策勒县的‘红柳’肉苁蓉（寄生在红柳植物根部）和‘梭梭’肉苁蓉（寄生藜科植物梭梭的根部），挑选外表无损伤、新鲜的肉苁蓉用于分析（图1）；外标物正构酮C4～C9 山东海能科学仪器有限公司。

图1 新疆不同寄主肉苁蓉外观及切面图Fig.1 Appearance and section of different hosts of Cistanche deserticola in Xinjiang

FA1004 电子天平上海天平仪器厂；Flavour-Spec®气相-离子迁移谱仪配备MXT-5 色谱柱（15 m×0.53 mm，1.0 μm），德国G.A.S 公司；20 mL顶空瓶上海希言科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备将两种肉苁蓉洗净，去除表皮并切碎成丁，用天平准确称取0.6 g，分别放入20 mL 顶空瓶中，60 ℃孵化20 min 后进样，每个样品进行3 次平行测定。

1.2.2 GC-IMS 分析参考Zhou 等[31]的方法，并略有修改。

进样条件：顶空进样针温度85 ℃；进样体积300 μL；孵化转速500 r/min。

GC条件：色谱柱：MXT-5（15 m×0.53 mm，1.0 μm）；色谱柱温60 ℃；分析时间20 min。

IMS 条件：IMS 温度45 ℃，漂移气流量75 mL/min；高纯氮气N2（纯度≥99.999%）作为漂移载气。载气流速：初始流速为2 mL/min，保持2 min 不变，2～10 min 之间逐渐增加至10 mL/min，10～20 min 内逐渐增加至100 mL/min。

保留指数计算公式：

式中，t 为保留时间；Z 和Z+1 分别为目标化合物（X）流出前后的正构酮所含碳原子的数目。

1.3 数据处理

GC-IMS 仪器自带LAV（laboratory analytical viewer）分析软件，采用正构酮C4～C9 作为外标来计算挥发性物质的保留指数，并根据保留指数和相对迁移时间，与NIST 气相数据库和IMS 离子迁移谱数据库进行检索对挥发性风味物质进行定性分析。使用插件Gallery Plot 构建指纹图谱、利用Reporter 绘制二维差异谱图、Dynamic PCA 进行主成分分析，根据挥发性物质峰体积使用Origin 2023 绘制聚类热图；香气特征来自好香味公司（The Good Scents Company）。

2 结果与分析

2.1 不同寄主肉苁蓉中挥发性物质的差异分析

根据保留时间、相对迁移时间和离子峰强度，利用LAV 分析软件中Report 插件功能，分别生成了三维图谱（图2）和二维差异图谱（图3），图谱背景呈现蓝色，相对迁移时间1.0 处红色竖线为经过归一化处理的反应离子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP 右侧的点代表肉苁蓉所含的挥发性成分，颜色越深代表所含物质的峰强度越高。由图2 可以看出，不同寄主肉苁蓉所含挥发性成分已被有效分离，并且挥发性成分的差异可以明显观察到，如黑色框中所示，不同寄主肉苁蓉中的挥发性物质种类存在差异，同一挥发性物质的含量也有不同。

图2 不同寄主肉苁蓉中挥发性物质GC-IMS 三维谱图Fig.2 GC-IMS three-dimensional spectrum of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

图3 不同寄主肉苁蓉中挥发性物质GC-IMS 二维谱图（A）和GC-IMS 二维差异谱图（B）Fig.3 GC-IMS two-dimensional spectra (A) and GC-IMS twodimensional difference spectrum (B) of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

采用Reporter 二维差异谱图模式，可以更清晰直观地比较不同样本间挥发性物质的差异。图3B差异谱图是以‘红柳’样品为基准扣除‘梭梭’样品所形成的谱图，扣除背景后呈现白色。由图可知，‘红柳’肉苁蓉和‘梭梭’肉苁蓉中大多数挥发性物质的相对迁移时间在1.10～1.60 ms 范围内，‘红柳’在1.10～1.60 ms 出现较强信号，‘梭梭’则在1.10～1.30 ms 出现较强信号，‘红柳’在保留时间100～800 s 范围内，‘梭梭’则在100～400 s 范围内。从图中可以看出，‘红柳’肉苁蓉中挥发性物质浓度明显高于‘梭梭’肉苁蓉。

2.2 不同寄主肉苁蓉挥发性物质的定性分析

本研究在两种肉苁蓉中共检出35 个信号峰。通过GC-IMS 中VOCal 软件内置的NIST 数据库和IMS 数据库进行定性分析，图4 显示了不同寄主肉苁蓉的挥发性物质特征峰点位图。其中共定性出27 种挥发性成分，包括8 种醛类、5 种醇类、4 种酯类和1 种酮类。由于数据库的数据有限，目前有8 种物质无法定性。但需要注意的是，有些化合物同时检测出单体和二聚体（部分挥发性物质浓度较高会形成二聚体，并出现对应的迁移峰），具体成分详见表1。

表1 ‘红柳’肉苁蓉与‘梭梭’肉苁蓉中挥发性成分定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile components in 'Red Willow' and 'Haloxylon' Cistanche deserticola

图4 不同寄主肉苁蓉的挥发性物质特征峰点位图Fig.4 Characteristic peak locations of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

2.3 不同寄主肉苁蓉挥发性风味物质聚类热图及指纹图谱分析

图5 是将两种肉苁蓉挥发性物质成分的峰体积绘制聚类热图，由图可知，‘梭梭’和‘红柳’肉苁蓉各自聚为一类，两种不同寄主肉苁蓉挥发性物质存在差异。为了进一步方便观察比较，利用Gallery Plot 插件绘制肉苁蓉样品中挥发性风味成分指纹图谱（图6），图中每一行代表一个样品中选取的信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰。信号峰颜色越亮，含量越高。从图6 指纹图谱可知，红框中挥发性物质在‘红柳’肉苁蓉中信号峰强度较高，包括2-苯基乙醛、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、3-甲硫基丙醛、1-己醛、3-甲基-2-丁烯醛、庚醛、乙酸甲酯、乙酸己酯等。黄框中挥发性物质在‘梭梭’肉苁蓉中信号峰强度较高，包括1-己醇、异丁醇、乙酰妥英、乙酸乙酯等。醛类化合物是肉苁蓉中重要的香气物质，由于其不饱和脂肪酸的氧化产生的醛类物质会带来独特的芳香[32]，醛类物质含量的不同使两者的风味产生较大差异。‘红柳’肉苁蓉中的2-苯基乙醛（蜂蜜味）、苯甲醛（苦杏仁味）、（E）-2-庚烯醛（柑橘味），3-甲硫基丙醛（洋葱味）等醛类化合物信号峰强度较高，且3-甲硫基丙醛会呈现较强烈洋葱味，低浓度时则会呈现愉快的肉汤香味[33]，因此‘红柳’肉苁蓉可能比‘梭梭’肉苁蓉有着更强烈的味道。而醇类和酯类物质的香气特征赋予肉苁蓉花草香气和果香[34]。‘梭梭’肉苁蓉中信号峰强度较高的1-己醇（花香和果香）、乙酰妥英（甜甜的奶香味）、异丁醇（清新的香草味）、乙酸乙酯（令人愉快的水果香）会给果实带来青香，这可能是‘梭梭’肉苁蓉闻起来更加清新的原因。

图5 不同寄主肉苁蓉挥发性成分聚类热图Fig.5 Clustering heat map of volatile components of Cistanche deserticola in different hosts

图6 不同寄主肉苁蓉挥发性成分指纹图谱Fig.6 Fingerprints of volatile components of Cistanche deserticola in different hosts

2.4 不同寄主肉苁蓉挥发性成分主成分分析

主成分分析（PCA）是一种有效的化学计量学方法。在充分利用大部分原始变量信息的基础上，该方法能将多个指标简化为多个综合指标，进一步简化数据并揭示变量之间的关系[35]。通过GC-IMS 获取的肉苁蓉关于挥发性成分的基础上，利用PCA 统计学对两种肉苁蓉进行分析，Dynamic PCA 插件分析结果见图7。由图7 可知PC-1 贡献率为83%，PC-2贡献率为8%，所累计贡献率为91%，远大于可信值60%以上，因此PC-1 和PC-2 主成分足以反映肉苁蓉样品香气特征信息。另外由图7 可以直观看出不同寄主肉苁蓉之间有明显区分度，且平行样品之间相互聚集，因此，可以根据特征挥发性物质来区分不同寄主肉苁蓉。

图7 不同寄主肉苁蓉的主成分分析（PCA）图Fig.7 Principal component analysis (PCA) graph of different hosts of Cistanche deserticola

此外，本实验采用VOCs 软件分析方法—“最近邻”指纹相似度进行了分析，该功能可对样本进行快速比较，通过计算样本的之间的欧式距离，从而可以通过检索最小距离来找到“最近邻”。此功能可根据所选评估区域中化合物的强度对A、B 两种不同寄主的肉苁蓉样品进行快速比较。从图8 可以看出A‘红柳’肉苁蓉和B‘梭梭’肉苁蓉中挥发性物质差异明显。

图8 不同寄主肉苁蓉的“最近邻”指纹分析Fig.8 "Nearest neighbor finger" fingerprint analysis of different hosts of Cistanche deserticola

3 结论

本研究采用GC-IMS 分析可知，‘梭梭’和‘红柳’肉苁蓉中共检测出35 种挥发性风味物质（包括单体、二聚体），由于内置NIST 数据库不够完善，目前只定性出其中的27 种挥发性物质，包括醛类、醇类、酯类、酮类化合物等，以醛类、醇类为主。‘梭梭’和‘红柳’肉苁蓉主要差异物质为2-苯基乙醛、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、3-甲硫基丙醛、1-己醛、庚醛、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸甲酯、乙酸己酯、1-己醇、乙酰妥英、异丁醇、乙酸乙酯。然而本文仅仅只对两种不同寄主肉苁蓉的挥发性成分进行了定性分析，虽然通过指纹图谱和聚类热图能够直观地分辨出不同寄主肉苁蓉之间的挥发性物质的差异，但是并不能代表肉苁蓉所有的挥发性物质，后续可增加更多品种肉苁蓉的分析以及GC-MS 对其挥发性物质的定量分析，探讨其他寄主肉苁蓉挥发性物质之间的区别与联系。

总之，通过构建肉苁蓉GC-IMS 挥发性物质聚类热图、指纹图谱以及PCA 主成分分析，能够很好地分辨出两种不同寄主肉苁蓉的挥发性物质的差异，可为‘梭梭’和‘红柳’肉苁蓉的快速鉴定和挥发性风味物质研究提供理论参考。