响应面法优化准噶尔山楂总三萜提取工艺及其纯化工艺研究

冯 琳，罗世博，古丽格娜·皮达买买提，刘媛梦,3，高红艳,

（1.伊犁师范大学化学化工学院，新疆伊宁 835000；2.新疆普通高等学校天然产物化学与应用重点实验室，新疆伊宁 835000；3.污染物化学与环境治理重点实验室，新疆伊宁 835000）

准噶尔山楂（Crataegus songarica），属蔷薇科山楂属光核组，小乔木或灌木[1]，作为天山野果林的主要树种之一，准噶尔山楂具有较高的营养价值和药用价值[2]。其果实中含有多糖、黄酮和三萜等多种成分[3-4]，具有抗氧化、保肝和抗衰老等功效[5-7]，三萜类化合物在植物中部分以游离的形式存在，多数与糖以苷键或酯键相结合，其基本碳架是由30 个碳原子构成[8-9]，具有抗氧化[10]、保肝[11-12]、保护肾脏[13]、抗癌[14]、降血脂[15]、降糖[16]、抗炎[17]、抑菌[18]等生物活性，具有极大的药用价值。为了研究准噶尔山楂的药理作用是否与其总三萜的含量相关，首先对其总三萜的提取和纯化工艺进行优化，目前有关总三萜提取的方法主要有回流提取法、酶辅助提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法以及超临界CO2流体萃取法等。相比于其他提取方法，酶辅助提取法条件温和，操作方便且对环境无污染，是利用各种酶来破坏植物细胞壁的结构完整性，从而提高植物中生物活性物质的提取，多种酶协同作用，可以提高提取效率[19-20]，超声辅助提取法同样能够破坏细胞壁，使有效成分溶出。大孔树脂具有机械强度高、耐酸碱性能好、使用寿命长等优点，被广泛用于天然产物的分离纯化和富集[21-22]。

目前对准噶尔山楂总三萜的研究存在空缺，无法以现有研究高效利用准噶尔山楂。因此本文采用酶-超声分步提取法提取准噶尔山楂总三萜，运用比色法[23]以准噶尔山楂总三萜提取量为指标，通过单因素实验、正交试验和响应面试验探究准噶尔山楂的提取工艺和大孔树脂纯化工艺，为准噶尔山楂的进一步研究与开发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

准噶尔山楂 采于新疆伊犁州伊宁市内，去核，自然晾干至恒重，粉碎后过100 目筛，备用；无水乙醇 天津市致远化学试剂有限公司；冰乙酸、乙酸钠天津市福晨化学试剂厂；高氯酸 桃浦化工厂；香草醛 上海源叶生物科技有限公司，以上试剂均为分析纯；D101 型大孔吸附树脂 沧州茂全新材料科技有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、齐墩果酸标准品（≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；纤维素酶（＞3 U/mg）、中性蛋白酶（≥50 U/mg） 伊势久（江苏连云港）生物科技有限责任公司；果胶酶（500 U/mg）上海士锋生物科技有限公司。

BSA124S 电子天平 德国赛多利斯股份公司；YB-150 高速多功能粉碎机 永康市速峰工贸有限公司；HH-S1数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；KM-300DE 超声波清洗机 昆山美美超声仪器有限公司；TDZ5-WS 多管架自动平衡离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；WH220-HT 磁力搅拌器德国维根斯公司；Hei-VAP 旋转蒸发仪 德国海道夫公司；UV2550 紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单一酶提取单因素实验 准确称取0.5 g 准噶尔山楂粉末，选择纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶（质量比均为1%，2%，3%，4%，5%），以1:20 g/mL 的料液比加入pH5.0 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，55 ℃酶解60 min，后沸水浴灭活10 min，离心（4000 r/min，10 min），取上清液定容，计算总三萜提取量。

1.2.2 复合酶正交试验 根据单一酶提取单因素实验结果，选取纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶3 个因素，每个因素选取3 个水平，设计L9（34）正交试验，筛选复合酶的最优配比，正交因素水平如表1 所示。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Orthogonal experimental factor horizontal design

1.2.3 复合酶提取工艺单因素实验 以提取物中总三萜提取量为指标，固定其他实验条件，结合复合酶配比的正交试验结果，分别对料液比、酶解时间、酶解温度、酶解pH 等4 个因素对总三萜提取量的影响进行考察。

1.2.3.1 料液比对总三萜提取量的影响 称取0.5 g准噶尔山楂粉末，以最优复合酶配比加入复合酶，固定其他单因素条件为：酶解时间60 min，酶解温度为50 ℃，酶解pH5.0，考察料液比为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL 对总三萜提取量的影响。

1.2.3.2 酶解时间对总三萜提取量的影响 称取0.5 g准噶尔山楂粉末，以最优复合酶配比加入复合酶，固定其他单因素条件为：料液比1:20 g/mL，酶解温度为50 ℃，酶解pH5.0，考察酶解时间为30、60、90、120、150 min 对总三萜提取量的影响。

1.2.3.3 酶解温度对总三萜提取量的影响 称取0.5 g准噶尔山楂粉末，以最优复合酶配比加入复合酶，固定其他单因素条件为：料液比1:20 g/mL，酶解时间为60 min，酶解pH5.0，考察酶解温度为40、45、50、55、60 ℃对总三萜提取量的影响。

1.2.3.4 酶解pH 对总三萜提取量的影响 称取0.5 g准噶尔山楂粉末，以最优复合酶配比加入复合酶，固定其他单因素条件为：料液比1:20 g/mL，酶解时间为60 min，酶解温度为50 ℃，考察酶解pH 为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 对总三萜提取量的影响。

1.2.4 酶辅助提取准噶尔山楂总三萜的响应面优化设计 在单因素实验结果的基础上，以总三萜提取量为响应值，选择料液比（A）、酶解温度（B）和酶解时间（C）设计三因素三水平的响应面试验，试验因素水平如表2 所示。

表2 响应面试验因素水平Table 2 Factor level of response surface experiment

1.2.5 酶-超声分步提取准噶尔山楂总三萜 称取0.3 g 准噶尔山楂粉末，在最优酶解提取条件下提取后，滤渣以1:15 g/mL 的料液比加入70%的乙醇，在超声功率为120 W，超声温度为50 ℃的条件下提取30 min，抽滤，合并两次提取液，定容，计算总三萜提取量。

1.2.6 总三萜提取量的测定 准确称取5 mg 齐墩果酸标准品，70%乙醇溶解后定容至50 mL 容量瓶中，摇匀，即得0.1 mg/mL 的标准储备液。分别吸取标准储备液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 置于比色管中，水浴蒸干溶剂，根据前期探究显色条件的实验结果，分别加入0.4 mL 显色剂5%香草醛-冰乙酸，1.0 mL 稳定剂高氯酸（71%），60 ℃水浴15 min后，立即转移至冰水浴，5 min 后取出，加入5 mL 冰乙酸，摇匀，在最大吸收波长550 nm 处测定吸光度。横坐标为齐墩果酸的质量浓度C，纵坐标为吸光度A，绘制标准曲线，得到线性回归方程A=55.88724C-0.05808，R2=0.9995。公式（1）为准噶尔山楂总三萜提取量的计算公式[24]：

式中：C 为总三萜的质量浓度，mg/mL；V 为所取提取液体积，mL；n 为稀释倍数；m 为样品质量，g。

1.2.7 大孔树脂纯化准噶尔山楂总三萜提取物

1.2.7.1 上样液的制备 取准噶尔山楂粉末50 g，以1.2.5 的方法提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味，备用。

1.2.7.2 大孔树脂预处理 称取适量D101 型大孔树脂以95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后过滤，湿法装柱。先用95%的乙醇冲洗至流出液与蒸馏水混合无浑浊后，再用蒸馏水冲洗至流出液无醇味，备用[25]。

1.2.7.3 大孔树脂纯化准噶尔山楂总三萜的工艺优化 上样液浓度的选择：称取相同质量预处理好的D101 型大孔树脂5 份，湿法装柱，柱体积为20 mL，分别制备浓度为2、4、6、8、10、12 mg/mL 的上样液各10 mL，上样速度为1 mL/min 吸附后，均用5 BV的水和 95%乙醇分步洗脱，收集洗脱液，计算洗脱液中总三萜浓度，并根据公式（2）计算吸附率，确定上样液浓度。

式中，C0为起始样品溶液中总三萜浓度，mg/mL；C1为吸附后样品溶液中总三萜浓度，mg/mL。

上样量的选择：称取预处理好的D101 型大孔树脂，湿法装柱，上样液以1 mL/min 的流速上柱，流出液每5 mL 收集1 次，测定并计算每份流出液的总三萜浓度，绘制泄露曲线。

洗脱剂浓度的确定：称取5 份预处理好的D101型大孔树脂，湿法装柱，取5 份15 mL，6 mg/mL 准噶尔山楂总三萜提取液，以1 mL/min 的流速上柱，吸附完成后用蒸馏水洗至流出液无色，分别用体积分数为10%、20%、50%、70%、90%的乙醇洗脱，每10 mL 收集1 次洗脱液，计算每份洗脱液以及合并洗脱液中总三萜的浓度，绘制不同乙醇浓度动态解吸曲线，确定洗脱液体积和浓度。

1.2.8 准噶尔山楂总三萜纯度及回收率的计算 在上述筛选的纯化工艺条件下，用D101 型大孔树脂纯化准噶尔山楂总三萜粗提物，流出液旋干，取0.01 g总三萜纯化物（m1），以一定量（V1）的纯水溶解，按照

1.2.6 的方法测定其总三萜浓度（C2），并根据公式（3）和公式（4）计算纯度以及回收率[21]。

1.3 数据处理

每组实验平行做3 次，结果取平均值，数据使用Origin 2022 软件作图，并使用IBM SPSS Statistics 26 和Design-Expert 8.0.6 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单一酶提取效果

单一酶提取准噶尔山楂总三萜的用量结果如图1 所示，由图可知，随着酶用量的增加，4 种酶辅助提取效果均呈现先增加后减小的趋势，这可能是由于酶的作用使准噶尔山楂细胞的通透性增强，总三萜更易溶出，从而提高其提取效果，但达到最高点后呈现下降趋势，可能是过量的酶会包裹原料颗粒，不利于三萜的溶出，造成总三萜提取率的下降[26-27]。总体来看，果胶酶对准噶尔山楂总三萜的提取效果最好，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶辅助提取的最高提取量相近，但考虑到经济效益，选择木瓜蛋白酶进行后期实验。因此选择纤维素酶（2%、3%、4%），果胶酶（2%、3%、4%），木瓜蛋白酶（1%、2%、3%）进行正交试验确定复合酶辅助提取准噶尔山楂总三萜的酶比例。

图1 单一酶提取单因素实验Fig.1 Single factor experiment of single enzyme extraction

2.2 复合酶比例对总三萜提取量的影响

复合酶辅助提取准噶尔山楂总三萜的正交试验结果和方差分析结果见表3 和表4，通过极差分析可知，三种酶对准噶尔山楂总三萜提取结果的影响程度的顺序为A＞B＞C，即纤维素酶＞果胶酶＞木瓜蛋白酶，且据方差分析可知，纤维素酶对准噶尔山楂总三萜提取效果有显著影响（P＜0.05），果胶酶和木瓜蛋白酶无显著影响（P＞0.05）。确定复合酶提取准噶尔山楂总三萜的最优比例A3B3C2，即纤维素酶4%，果胶酶4%，木瓜蛋白酶2%，与正交试验结果一致。根据优化条件进行3 次平行实验，结果显示准噶尔山楂总三萜的平均提取量为（23.536±0.601）mg/g，说明此方法具有较好的稳定性和可行性。

表3 复合酶比例正交试验结果Table 3 Orthogonal experimental results of compound enzyme ratio

表4 方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

2.3 复合酶提取单因素实验

2.3.1 料液比对总三萜提取量的影响 由图2 可知，总三萜的提取量在此范围内随料液比的逐渐增大而呈现先增加后降低的趋势，当料液比达到1:20 g/mL时，总三萜提取量显著高于其他（P＜0.05），分析原因可能是提取剂的体积增加，使固液之间总三萜的浓度差增大，有利于其传质作用，但是由于样品中总三萜提取量有限，且其他物质也更容易被溶解，并与三萜竞争溶剂，导致料液比继续增加时，总三萜提取量呈现下降趋势[28-29]。因此，选择1:15、1:20、1:25 g/mL的料液比进行下一步响应面优化试验。

图2 料液比对总三萜提取量的影响Fig.2 Effect of liquid material ratio on the extraction amount of total triterpenoids

2.3.2 酶解时间对总三萜提取量的影响 由图3 可知，在30～60 min 时，准噶尔山楂总三萜的提取量呈现上升趋势，而60 min 之后则呈现逐渐下降趋势，酶解时间为60 min 时，提取物中总三萜提取量显著高于其他（P＜0.05）。这可能是由于酶解时间过短时，细胞壁的结构没有被完全破坏，酶解不充分，时间过长则会使更多其他成分溶解于提取液中，且可能会破坏有效成分的结构，影响总三萜的提取效果[30]。因此，选择酶解时间30、60、90 min 进行下一步响应面优化试验。

图3 酶解时间对总三萜提取量的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction amount of total triterpenoids

2.3.3 酶解温度对总三萜提取量的影响 由图4 可知，酶解温度对准噶尔山楂总三萜的提取效果影响较大，温度过高或过低都不利于总三萜的提取，当温度达到50 ℃时，提取液中总三萜的提取量最高，当温度持续升高时，总三萜的提取量出现急剧下降，分析原因可能是温度升高有利于提高酶活性和分子扩散速率，从而加快提取速率，但是温度超过50 ℃时，酶活性降低，提取效率下降[31]。因此，选择酶解温度45、50、55 ℃进行下一步响应面优化试验。

图4 酶解温度对总三萜提取量的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction amount of total triterpenoids

2.3.4 酶解pH 对总三萜提取量的影响 酶都有最适宜的pH，过酸或过碱都有可能造成酶的变性，从而失去活性。由图5 可知，准噶尔山楂总三萜的提取量随着酶解pH 的增大，总体呈现先增大后减小的趋势，当pH 为4.5 时，提取液中总三萜的提取量最高，继续增大pH 时，提取量反而下降，说明pH4.5 为酶解的最适宜pH，在此之外酶活性降低。因此，选择酶解的最适宜pH4.5 进行下一步实验。

图5 酶解pH 对总三萜提取量的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the extraction amount of total triterpenoids

通过以上单因素实验结果可以看出，料液比、酶解温度和酶解时间的不同均对准噶尔山楂总三萜的提取量有较大影响，而改变酶解pH 对准噶尔山楂总三萜提取量的影响不大，因此选择料液比、酶解温度、酶解时间进行响应面优化试验，在试验过程中，酶解pH 均为4.5。

2.4 响应面优化酶辅助提取准噶尔山楂总三萜的工艺

2.4.1 响应面试验结果 根据Box-Behnken 试验设计原理，优化提取工艺，分析各因素对总三萜提取效果的综合影响，试验结果见表5。

表5 响应面试验设计方案与结果Table 5 Test design and results of response surface methodology

运用Design-Expert 8.0.6 软件对表中数据进行分析和数据拟合，得到二项多次回归方程为：Y=36.72+0.13A+0.26B+0.29C+0.01AB+0.45AC-7.25×10-3BC-0.23A2-1.00B2-0.61C2。为检验方程是否有效，利用软件对其回归模型进行方差分析，结果见表6。由表6 可知，回归模型极显著（P＜0.01），R2=0.9536，失拟项不显著（P＞0.05），说明模型拟合较好，其他因素对实验结果的影响较小，可用于分析响应值，预测实验结果。由表6 可知，在一次项中，酶解温度（B）和酶解时间（C）对总三萜提取量的影响差异显著（P＜0.05），料液比（A）对总三萜提取量的影响差异不显著（P＞0.05），二次项中B2的影响高度显著（P＜0.0001），C2影响极显著（P＜0.01），交互项中AC 影响极显著（P＜0.01），AB 和BC 影响不显著（P＞0.05）。比较F值可知，各因素对提取量的影响大小顺序为：酶解时间（C）＞酶解温度（B）＞料液比（A）。

表6 回归模型方差分析结果Table 6 Results of variance analysis of regression model

通过回归方程作响应面图和等高线图（见图6），可以更直观地反映各因素的交互作用对总三萜提取量的影响。响应面图曲线弯曲明显，颜色变化快，等高线呈现椭圆形说明两个因素交互作用大，反之，曲线弯曲程度小，颜色变化不快，等高线呈现圆形，则说明两个因素交互作用对响应值的影响不明显。因此，由图6 可知，A（料液比）和C（酶解时间）的交互作用对总三萜提取量的影响最大，A（料液比）和B（酶解温度）交互作用影响其次，B（酶解温度）和C（酶解时间）的交互作用对总三萜提取量的影响最弱。

图6 各因素交互作用对准噶尔山楂总三萜提取量影响的响应面及等高线图Fig.6 Response surface and contour map of the effect of interaction of various factors on the total triterpenoids extraction amount of Crataegus songarica

2.4.2 最优工艺验证实验结果 运用Design-Expert 8.0.6 软件分析得出准噶尔山楂总三萜的最优提取工艺为：料液比为1:24.06 g/mL，酶解温度为50.66 ℃，酶解时间为75.99 min，预测在此条件下总三萜的提取量为36.865 mg/g。根据实际操作调节，调整最优条件为：料液比为1:24 g/mL，酶解温度为51 ℃，酶解时间为76 min。通过3 次平行实验验证，得到在此条件下总三萜的平均提取量为（36.570±0.332）mg/g，实验结果与预测值相近，说明此方法具有可行性且稳定性高。

2.5 酶-超声分步提取准噶尔山楂总三萜

在最优酶解条件下提取结束后，再进行超声提取，通过3 次平行实验，得出酶-超声分步提取准噶尔山楂总三萜的提取量为（53.782±0.673）mg/g。实验结果说明酶解后的滤渣再次进行超声提取能够明显增加总三萜的提取效果，且具有稳定性。

2.6 大孔树脂纯化准噶尔山楂总三萜提取物

2.6.1 大孔树脂纯化工艺

2.6.1.1 上样液浓度的选择 由图7 可知，吸附率在2～6 mg/mL 的范围内呈逐渐上升趋势，这可能是由于上样液浓度增大后，溶液中三萜与大孔树脂接触的几率也逐渐增大，而随着上样液浓度的进一步增加，样液中其他成分的浓度也会增大，与三萜竞争活性位点，导致吸附率呈下降的趋势[32]。当上样液浓度为6 mg/mL 时，大孔树脂吸附率最高，之后开始呈现下降趋势。

图7 上样液浓度对总三萜吸附率的影响Fig.7 Effect of loading concentration on the adsorption rate of total triterpenoids

2.6.1.2 上样量的选择 由图8 可知，随着上样体积的逐渐增加，流出液中的总三萜浓度呈现先平缓后快速上升，最后又平缓上升的趋势。当流出液为15 mL时，流出液中总三萜的浓度上升到上样液总三萜浓度的1/10，达到泄露点[11]，随后总三萜开始大量泄露，因此选择15 mL 为上样液体积。当流出液体积为60 mL 后，流出液总三萜浓度逐渐与上样液总三萜浓度接近，因此上样液体积最大不应超过60 mL。

图8 大孔树脂动态吸附曲线Fig.8 Dynamic adsorption curve of microporous resin

2.6.1.3 洗脱液的选择 不同乙醇浓度的解吸曲线如图9 所示。由图9 可知，当乙醇浓度为70%和90%时，均能够迅速将吸附的三萜洗脱下来，在洗脱液通过体积为20 mL 时达到高峰，洗脱液体积为50 mL时，被吸附的三萜类化合物基本被洗脱，洗脱曲线出峰快，无明显拖尾现象，而乙醇浓度较低时，三萜难以被洗脱。因此为了节约试剂，并提高纯化效率，选择70%的乙醇进行洗脱，洗脱液体积为50 mL。

图9 不同乙醇浓度时大孔树脂的洗脱曲线Fig.9 Elution curves of macroporous resin at different ethanol concentrations

2.6.2 大孔树脂纯化准噶尔山楂总三萜提取液的工艺 在以上优化的纯化条件下纯化准噶尔山楂总三萜粗提物，经测定计算得纯化前后总三萜的纯度由2.52%提高至29.93%，回收率为81.25%。实验结果表明D101 型大孔树脂能够用于纯化准噶尔山楂总三萜，回收率较高，但纯化效果一般，提取物中仍含有其他成分，说明大孔树脂只能除去一部分杂质，并不能达到精制的目的，若想得到纯度高的总三萜纯化物，还需进行二次纯化。

3 结论

通过设计正交试验和响应面试验确定准噶尔山楂总三萜的最优提取条件为纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量分别为4%、4%和2%，料液比为1:24 g/mL，温度51 ℃，pH 为4.5，酶解76 min，提取量为（36.570±0.332）mg/g，通过超声再次提取后，总三萜提取量达到（53.782±0.673）mg/g,说明酶-超声分步提取法能够显著提高准噶尔山楂总三萜的提取量。其次，通过D101 型大孔树脂确定纯化工艺为：上样液浓度为6 mg/mL，流速：1 mL/min，上样量：15 mL，洗脱条件为50 mL，70%乙醇，纯化后的准噶尔山楂总三萜的纯度可达29.93%，回收率为81.25%，说明大孔树脂可以除去一部分杂质，提高准噶尔山楂总三萜的纯度，但若想得到纯度更高的三萜纯化物，还需进一步纯化精制。以上提取工艺和纯化工艺的建立，均为准噶尔山楂总三萜的成分研究和富集提供了新的实验依据，而且方法条件温和，效率高且稳定性好。实验只针对提取的酶解部分进行了条件优化，对超声部分的提取条件还有待进一步优化，同时还需要对大孔树脂纯化后的纯化物进行进一步精制，并对其纯化前后的生物活性进一步研究。

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