泽泻醇B对HepG2细胞体外糖吸收的影响初探

王晨炜 蔡增宏 丘志龙 林燕玲 曾敏洁 李玲燕 韩丹 秦家乐 张伟云

【摘 要】 目的：探索泽泻醇B对HepG2细胞糖吸收的影响。方法：以不同浓度的泽泻醇B处理HepG2细胞，经CCK-8法（Cell Counting Kit-8细胞计数试剂，CCK-8），评估泽泻醇B对细胞增殖的影响。将不同培养基培养的HepG2细胞分别采用药物处理后，加入2-NBDG（2-［N-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-氨基］-2-脱氧葡萄糖，2-NBDG）为葡萄糖荧光示踪剂，用流式细胞仪测定细胞荧光强度，以此评估泽泻醇B对HepG2细胞糖吸收的影响。结果：CCK-8实验结果表明：在1～10 μmol/L范围内，泽泻醇B对HepG2细胞增殖的情况影响较小。糖吸收测定实验结果表明：在模拟的条件下，泽泻醇B表现出对HepG2细胞糖吸收有不同程度的促进作用。结论：初步确定泽泻醇B可促进HepG2细胞的糖吸收，提示了泽泻醇B可能是泽泻降血糖的有效成分之一。

【关键词】

泽泻；泽泻醇B；糖吸收；HepG2细胞

【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2024）01-0018-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.01.zgmzmjyyzz202401005

Preliminary Study on the Effect of Alisitol B on Glucose Uptake in HepG2 Cells in vitro

WANG Chenwei1 CAI Zenghong1 QIU Zhilong1 LIN Yanling1 ZENG Minjie1

LI Lingyan1 HAN Dan1 QIN Jiale1 ZHANG Weiyun1，2*

1. Department of Pharmacy， Xiamen Medical College/Xiamen Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Bioengineering， Fujian Province， Xiamen 361023，China;

2.College of Pharmacy， Fujian Medical University， Fujian Province， Fuzhou 350122， China

Abstract：Objective To investigate the effect of Alisol B on glucose absorption in HepG2 cells.Methods HepG2 cells were treated with different concentrations of AlisolB.Cell absorbance values were measured by CCK-8 method （cell Counting Kit-8 cell counting reagent， CCK-8） to evaluate the effects of Alisol B on cell proliferation.HepG2 cells cultured indifferent mediawere treated with drugs， and 2-NBDG （2-［N-7-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazo-4-amino］-2-deoxyglucose， 2-NBDG） was added as glucose fluorescent tracer， and the cell fluorescence intensity was measured by flow cytometry at a wavelength to evaluate the effect of Alisol B on glucose uptake in HepG2 cells.Results The results of CCK-8 experiments showed that in the range of 1～10 μmol/L， Alisol Bhad little effect on the value-added of HepG2 cells. The results of glucose absorption assay showed that Alisol B could promote the glucose absorption of HepG2 cells in different degrees under four simulated experimental environments.Conclusion It was preliminarily confirmed that Alisol B had a positive effect on the glucose absorption of HepG2 cells， and it was verified that Alisol B was one of the active ingredients for HepG2 cells in hypoglycemic.

Keywords：Alisma; Alisol B; Glucose Absorption; HepG2 Cells

糖尿病在中医中被称为“消渴病”，近年来已成为全球性公共卫生问题，其中以2型糖尿病为主^［1］。中医治疗消渴病已有悠久的历史，记载了许多有效的复方，泽泻因降血糖功效在许多治疗消渴的复方中都有被应用^［2-3］。泽泻为泽泻科植物东方泽泻Alismaorientale（Sam.） Juzep.或泽泻Alisma plantag-aquatica Linn.的干燥塊茎。泽泻性寒，味甘、淡，归肾、膀胱经，具有利水渗湿、泄热、化浊降脂的功效^［4］。现代药理研究^［5-7］证实，泽泻具有降血糖、调血脂、抗肿瘤、抗炎、利尿、抗动脉粥样硬化等药理作用。泽泻药材中主要成分为萜类成分，包括三萜类、倍半萜类和二萜类，据文献^［8-9］报道，其中三萜类化合物可能是泽泻降血糖活性的有效成分之一，而泽泻醇B是泽泻三萜类中的重要化合物，在泽泻中有较高含量^［10］。目前有研究报道泽泻三萜单体能够刺激3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取作用，其中包含泽泻醇B、泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、24-乙酰泽泻醇A等，其结构均为原萜烷型四环三萜^［11-12］，但尚未有关泽泻醇B对于HepG2细胞葡萄糖吸收作用的报道，本文旨在通过建立HepG2细胞模型探索泽泻醇B对HepG2细胞体外糖吸收的影响。HepG2细胞系高度分化的肝癌细胞株，其生物学特性与正常肝细胞相近，在高水平的胰岛素条件下，该细胞表面胰岛素受体的数目下降程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈正相关，且细胞能无限增殖，具有易于体外培养的特点，故HepG2细胞常被用于体外糖吸收的细胞模型建立^［13-14］。罗格列酮为噻唑烷二酮类降糖药，是目前治疗2型糖尿病的常用药物之一^［15-16］。本实验以泽泻醇B为研究对象，以罗格列酮为阳性对照物，采用流式细胞仪测定HepG2细胞吸收2-NBDG后的荧光强度，以此观察泽泻醇B对HepG2细胞糖吸收的影响，初步探究泽泻醇B是否有降血糖活性的潜力。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Multiskan Go全波长酶标仪，美国Thermo Fisher科技有限公司生产；FC500分析型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司生产；IC1000细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司生产。

1.2 材料 泽泻醇B（HPLC≥ 98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；葡萄糖荧光示踪剂、CCK-8试剂盒、罗格列酮，均购自美国APExBIO公司；胰岛素、DMEM低糖培养基、1×PBS缓冲液、100×青霉素-链霉素溶液，均购自Biosharp生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA，购自Thermo Fisher科技有限公司；葡萄糖（GC≥99.5%），购自美国西格玛Sigma-Aldrich公司；胎牛血清，购自德国Cegrogen Biotech公司。

2 方法

2.1 HepG2细胞培养 取HepG2细胞转移至含1%青霉素、链霉素，10%胎牛血清的培养基中，放入37 ℃，5%CO₂培养箱中培养。

2.2 CCK-8法细胞增殖/毒性检测 取HepG2细胞，用无血清培养基稀释至3×10⁴cells/mL，按每孔100 μL接种至96孔板中，在37 ℃，5%CO₂培养箱中培养24 h。设置对照组与待测药物实验组，对照组不进行药物处理，待测药物实验组分成两组分别加入100 μL1 μmol/L和100 μL10 μmol/L泽泻醇B，1 h后，吸去药物，加入100 μL10% CCK-8，培养2 h，用全波长酶标仪在450 nm下测定各组细胞的吸光度，以对照组作为100%，进行结果的比较分析。

2.3 HepG2细胞糖吸收测定 准备无血清DMEM低糖培养基（5.5 mmol/L）、无血清DMEM高糖培养基（30 mmol/L），并配置1 μmol/L胰岛素，通过高糖环境模拟胰岛素抵抗^［17］。以无血清DMEM低糖培养基模拟低糖环境；以无血清DMEM高糖培养基模拟高糖环境；以无血清DMEM低糖培养基加入1 μmol/L胰岛素模拟在胰岛素刺激下的低糖环境；以无血清DMEM高糖培养基加入1 μmol/L胰岛素模拟在胰岛素刺激下的高糖环境。参考文献^［18］方法，取汇合度70%～80%的细胞，将细胞稀释成3×10⁴cells/mL，每孔2 mL接种至24孔板中，在37 ℃、5%CO₂培养箱中培养24 h。设置空白对照组、罗格列酮阳性对照组、泽泻醇B组，空白对照组不进行药物处理，阳性对照组分别加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的罗格列酮，泽泻醇B组分别加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的泽泻醇B。每个实验组内设置2个复孔，其中1孔额外加入10 μmol/L的2-NBDG处理细胞，另一孔不做处理，加药结束后培养1 h，加入450 μLPBS转移至流式细胞管，用流式细胞仪在488 nm下测定1000个细胞吸光度平均值。设置空白对照组的荧光强度为100%。将未加入2-NBDG处理的细胞荧光强度作为背景值，用于扣除细胞和药物本身的背景荧光强度。上述实验均重复3次。

3 结果

3.1 泽泻醇B对HepG2增殖/毒性影响 以0.1%DMSO为空白对照，1 μM泽泻醇B细胞活力为 （99.17±0.25）%，10 μM泽泻醇B细胞活力 （98.96±0.27）%，两组结果均提示泽泻醇B对细胞生长的影响较小，无显著性差异。

3.2 不同浓度泽泻醇B在低糖环境下对HepG2糖吸收的影响 实验结果表明，在低糖环境下，10 μmol/L的泽泻醇B对HepG2细胞的糖吸收有明显促进作用，葡萄糖吸收率增加达116%（如图1）。

3.3 不同浓度泽泻醇B在高糖环境下对HepG2糖吸收的影响 实验结果显示，在高糖环境下，5 μmol/L的泽泻醇B对HepG2细胞的糖吸收率增加达156%，其促进糖吸收活性与罗格列酮差异不大，提示了泽泻醇B能显著促进HepG2细胞对葡萄糖的吸收（如图2）。

3.4 不同浓度泽泻醇B在胰岛素刺激的低糖环境下对HepG2糖吸收的影响 实验结果表明，在胰岛素刺激的低糖环境下，1 μmol/L和10 μmol/L的泽泻醇B对HepG2细胞的糖吸收都产生促进作用，其中10 μmol/L的泽泻醇B对HepG2细胞的糖吸收的促进作用十分显著，葡萄糖吸收率增加达48%（如图3）。

3.5 不同浓度泽泻醇B在胰岛素刺激的高糖环境下对HepG2糖吸收的影响 实验结果表明，在胰岛素刺激的高糖环境下，1 μmol/L和10 μmol/L的泽泻醇B對HepG2细胞的糖吸收都表现出明显的促进作用，前者葡萄糖吸收率增加达23%，后者葡萄糖吸收率增加达31%，两组表现出的促进糖吸收活性效果都与罗格列酮相近（如图4）。

4 讨论

罗格列酮是用于治疗2型糖尿病的西药^［17］，有相关文献^［19］指出长期使用罗格列酮会使患者出现心衰、肝功能损伤等副作用，而使用中药治疗糖尿病及其并发症不仅能标本兼治，药效明显，且无明显不良反应^［20］。因此探究中药有效降血糖活性成分对临床上治疗糖尿病有十分重大的意义。

实验采用泽泻醇B为实验对象，以罗格列酮为阳性药物，探究泽泻醇B对HepG2细胞糖吸收的影响。实验结果显示在模拟的低糖环境下10 μmol/L、高糖环境下5 μmol/L、胰岛素刺激的低糖环境下10 μmol/L、胰岛素刺激的高糖环境下1 μmol/L用量的泽泻醇B均展示出了与罗格列酮相近的促进葡萄糖吸收的活性，初步提示泽泻醇B可能为泽泻降血糖的有效化学成分之一。因本实验仅用细胞模型初步探究了泽泻醇B促进葡萄糖吸收的活性，今后可进一步采用小鼠模型^［21］开展实验，研究泽泻醇B是否具有降血糖活性并深入探究其作用机制。另外，本实验结果显示罗格列酮在有无胰岛素条件下对糖吸收的影响没有显著差异，其具体原因及作用机制尚需深入研究。

实验结果表明在模拟的4种环境下，不同浓度的泽泻醇B对HepG2细胞的糖吸收均有促进作用，提示泽泻醇B可能为泽泻降血糖的有效成分之一。该结果为研究泽泻降血糖物质基础提供了数据参考，为后续研发泽泻相关药物降低血糖、治疗糖尿病提供了初步依据。

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（收稿日期：2023-04-04 编辑：刘 斌）

基金项目：福建省卫健委医学创新课题（2019-CXB-26）；厦门市医疗卫生指导性项目（3502Z20224ZD1309）；厦门医学院大学生创新创业项目（X202212631016，X202212631025）；厦门医学院校级一流课程项目（XBJK2021027）；厦门医学院教育教学改革研究项目-金课建设培育计划（XBJK2019013）。

作者简介：王晨炜（2000—），男，汉族，本科，研究方向为中药活性成分及其作用机理。E-mail： 596950705@qq.com

通信作者：张伟云（1980—），女，汉族，博士，教授、硕士生导师，研究方向为药物分析、中药活性成分及其作用机理。E-mail： zhangwy@xmu.edu.cn