高地芽孢杆菌对稻瘟病的防治及促生作用

卫甜，杨倩，刘怀阿，朱锦磊，吕敏

（江苏里下河地区农业科学研究所，江苏扬州 225007）

0 引言

水稻是全世界主粮作物之一，全球近50%的人口以此为食[1]。中国水稻种植面积居世界第2位[2]。由病原真菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是水稻生产上一种毁灭性病害，每年可造成10%～30%的产量损失，直接经济损失更高达50亿美元[3]。目前，主要依靠施用杀菌剂防治稻瘟病，过量使用杀菌剂会导致病原菌抗性增强、环境污染加重及稻米残留等。芽孢杆菌具有对人畜安全、不污染环境、病原菌不易产生抗药性、抗逆性强和促进植物生长等优点，成为稻瘟病防治上的重要生防菌[4]。已有较多关于芽孢杆菌有效防治稻瘟病的研究报道。Taguchi 等[5]发现枯草芽孢杆菌IK-1080 的培养滤液当芽孢浓度在1×108CFU/mL 和5×108CFU/mL 时，叶瘟的发生率分别减轻13.8%和7.7%，产量损失减少52.2%和73.5%；张芬[6]研究发现，枯草芽孢杆菌T492对稻瘟病抑制率达62.6%；从海洋细菌中分离的枯草芽孢杆菌HW-14 对多个稻瘟病菌生理小种的抑菌圈直径在18 mm以上[7]；沙月霞等[8]从水稻叶片表面分离获得2 株枯草芽孢杆菌，其发酵液对叶瘟的田间防效为71.5%～85.1%，对穗瘟的田间防效则为63.5%～85.6%；官颖[9]发现的特基拉芽孢杆菌GYLH-1对防治稻瘟病具有显著效果。

基于合理利用有益微生物资源，开发高效、安全的生防菌剂的目的，本研究选用实验室前期酶活、平板拮抗等初步筛选防治稻瘟病的表现最佳的2株高地芽孢杆菌[10]，在温室及田间条件确定菌株的防病促生能力，得到防效高和促进水稻生长的生防菌株，以期为其田间高效应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)JYW21、JYW26于2018 年在江苏省扬州市广陵区湾头水稻试验基地稻瘟病发生严重的田块分离筛选得到。稻瘟病病原真菌由江苏里下河地区农业科学研究所植物保护研究室分离保存。

供试水稻品种为‘南粳9108’，用于2 株高地芽孢杆菌防治及促生效果测定。将水稻种子进行表面消毒（70%无水乙醇表面消毒1～2 min，灭菌水润洗5次），催芽播种于装满基质（营养土:蛭石为1:1）的一次性塑料杯中，每杯12粒，置于温度28℃、相对湿度70%、光周期为16 h/8 h的温室中培养2周后进行相关试验研究。

1.2 B.altitudinis发酵液及稻瘟病菌悬浮液的制备

1.2.1B.altitudinis发酵液制备B.altitudinisJYW21、JYW26在LB培养基平板上37℃活化培养16～24 h，挑选单菌落转接到LB 试管液体培养液中培养16～18 h(28℃，200 r/min)。接着将培养好的种子液以1%的接种量转入灭菌的LB三角瓶培养液中28℃200 r/min扩大培养24 h，稀释浓度为1×108～1×109CFU/mL备用。

1.2.2 稻瘟病菌悬浮液制备使用灭菌接种针将4℃斜面保存的稻瘟病真菌转接到PDA 固体平板培养基上25℃培养5～7 d，接着转接到玉米稻秆粉固体培养基上让其继续生长至菌落长满培养基；用灭菌水轻轻洗去菌丝后放置黑光灯下3 d诱导产孢；最后加入适量灭菌清水将平板培养基上的稻瘟菌分生孢子冲洗下来；收集冲洗液并用两层纱布过滤，通过显微镜观察计数，调整菌液浓度为10 倍显微镜下每个视野有20～60 个孢子备用。

1.3 离体叶片法评价B.altitudinis对稻瘟病的生防效果

按照1.2的方法分别制备B.altitudinis发酵液及稻瘟病菌孢子悬浮液。剪取5 cm 长健康水稻叶片分别放入2 株B.altitudinis发酵液中于摇床200 r/min 振荡浸泡1 h，对照在无菌水中浸泡1 h；在9 cm培养皿底部铺一张滤纸，再在湿润的滤纸上放置灭菌牙签，在牙签上放置浸泡后叶片，然后将其放在人工气候箱培养72 h；用灭菌牙签轻刺叶段表面，每个叶段刺伤5个点，用移液枪吸取10µL稻瘟病菌抱子悬浮液分别接种在刺伤的5 个点上，每个处理15 个叶段，重复3 次；所有处理在人工气候箱培养7 d后调查接种点稻瘟病病斑数量，根据病斑扩展面积计算病情指数[11-12]。

1.4 温室评价B.altitudinis对稻瘟病的生防效果

参照1.2方法将稀释好的B.altitudinis发酵液加入终浓度为0.01%吐温-20 后均匀喷施植物。B.altitudinis处理水稻叶片5 d 后喷雾接种稻瘟病菌，确保所有叶片均匀布满菌液。将水稻置于100%湿度的温室中培养24 h。接种稻瘟病菌20 d后开始统计水稻病株数，病情指数和防效的计算如式(1)～(2)。

1.5 B.altitudinis对水稻种子萌发及秧苗生长影响

参照何龙生[13]的试验方法，略有改动。水稻种子经表面消毒后，置于B.altitudinis发酵液中浸泡1 d，以清水浸泡为对照；将处理好的种子均匀放入铺好2 层滤纸的培养皿中催芽，随机数取100粒，4次重复；种子发芽过程中保持滤纸湿润即可；将培养皿置于28℃、16 h 光照/8 h 黑暗的培养箱中培养，5 d 后统计发芽种子数，计算发芽率，如式(3)。培养至15 d，测量并记录所有种子秧苗长及整株鲜重。

1.6 温室评价B.altitudinis对水稻促生作用

参照1.2方法将稀释好的B.altitudinis发酵液加入终浓度为0.01%吐温-20后喷施水稻，以喷施清水作为对照。B.altitudinis喷施30 d后测量水稻株高、地上部分鲜重、根长、根重及叶片叶绿素含量等指标。叶片叶绿素含量测定使用植物叶绿素含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。

1.7 田间评价B.altitudinis对水稻防病促生效果

选取健康且长势一致的‘南粳9108’水稻种子放入1×108CFU/mLB.altitudinis的发酵培养液中浸种1 h后清水浸泡催芽。将露白种子播种于水稻育秧池中，20 d后调查水稻秧苗的株高和整株鲜重。将喷施JYW21、JYW26及清水对照的秧苗分别进行移栽，每小区面积25 m2，设3 个重复。水稻插秧后35 d 第2 次喷雾B.altitudinis发酵液，60 d 左右调查叶瘟、株高及分蘖数，100 d左右调查穗瘟、稻曲病及纹枯病发生情况。收割时调查水稻穗长、穗重和千粒重，计算B.altitudinis对水稻的促生效果。病情指数调查方法参照《农药田间药效试验准则》，调查方法为每小区内对角线5 点取样，每点查10丛稻，每丛稻查5片叶，共计50片叶。

1.8 数据处理

试验数据采用DPS和Excel 2013进行统计分析和作图，并通过最小极差法(LSD)比较不同处理下指标差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 B.altitudinis对稻瘟病的生防效果

采用不同试验条件验证B.altitudinis的生防效果。离体叶片法B.altitudinisJYW21、JYW26 对叶瘟防效在96%以上，2 个处理之间无明显显著差异（表1）；温室喷雾接种稻瘟病，B.altitudinisJYW26对稻瘟病的防效达到79.83% ，而B.altitudinisJYW21 高达82.39%；田间自然发病，B.altitudinisJYW21、JYW26 对叶瘟的防效可达55%以上，穗瘟则高达70%以上，2 个菌株之间无显著差异。根据不同条件下2 株高地芽孢杆菌对稻瘟病的生防效果可知，B.altitudinisJYW21、JYW26 均可显著降低稻瘟病发生。

表1 高地芽孢杆菌不同条件下对叶瘟的生防效果

2.2 B.altitudinis对水稻其他病害的田间防效

除调查稻瘟病，田间条件下调查了2 株高地芽孢杆菌对水稻其他主要病害（纹枯病、稻曲病）的生防效果，结果如表2所示。B.altitudinisJYW26对纹枯病和稻曲病的田间防效分别为41.43%和66.89%；JYW21对纹枯病和稻曲病的防效分别为63.76%和36.49%。由此可见，B.altitudinisJYW26 对稻曲病的防效优于纹枯病，而B.altitudinisJYW21 对纹枯病的防效优于稻曲病。

表2 高地芽孢杆菌对水稻其他主要病害的生防效果

2.3 B.altitudinis对水稻促生作用

2.3.1 对水稻种子萌发及秧苗生长的促进通常用发芽率反映种子发芽能力，发芽率越高，增产潜力越大。由表3可以看出，2株高地芽孢杆菌处理后水稻种子发芽率均显著高于清水对照(91.75%)，提升率大于6%，可显著促进水稻种子萌发。B.altitudinisJYW26 处理水稻苗高为12.02 cm，相比清水对照提升14.91%；鲜重为0.18 g，提升率为28.57%。B.altitudinisJYW21处理水稻苗高为11.81 cm，相比清水对照提升12.91%；鲜重为0.17 g，相比清水对照提升21.43%。由此说明，2株高地芽孢杆菌能显著促进水稻种子萌发及秧苗生长。

表3 高地芽孢杆菌对水稻种子萌发及幼苗生长影响

2.3.2 温室条件下对水稻植株生长的促进温室促生试验发现，B.altitudinisJYW21 和JYW26 处理后分别促进水稻株高增加24.67%和18.67%、鲜重增加64.04%和61.79%、根重增加24.71%和25.88%、根长增加30.96%和27.94%（表4）。B.altitudinisJYW21 和JYW26 在促进水稻株高、鲜重、根长及根重方面均不存在显著差异。

表4 温室条件下高地芽孢杆菌对水稻植株生长影响

2.3.3 对水稻叶片叶绿素含量的促进如图1所示，2株高地芽孢杆菌显著增加了水稻叶片中叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量，B.altitudinisJYW21提高水稻叶片叶绿素含量作用更显著，推测这可能是高地芽孢杆菌促进水稻生长的原因之一。

图1 高地芽孢杆菌对水稻叶片叶绿素含量影响

2.3.4 田间条件下对水稻生长的促进田间条件下，B.altitudinis处理水稻种子20 d 后测量秧苗高及鲜重。由表5 可知，相对清水对照，B.altitudinisJYW21 对水稻秧苗期苗高及鲜重不存在显著差异，促生作用不明显，而B.altitudinisJYW26可提升秧苗高23.96%、鲜重63.64%。到水稻抽穗前期，由表6 可知，B.altitudinisJYW21与JYW26对促进水稻株高差异不显著，但可显著增加其分蘖数（分别为20.59%、15.27%）；在促产效果方面（表7），B.altitudinisJYW21、JYW26 能显著增加水稻千粒重（分别为4.77%、1.25%），两者对增加穗长均无显著差异。B.altitudinisJYW21 可显著增加19.55%穗重，在促产方面JYW21田间表现更为突出。

表5 田间条件下高地芽孢杆菌对水稻秧苗生长影响

表6 田间条件下高地芽孢杆菌对水稻植株生长影响

表7 田间条件下高地芽孢杆菌对水稻产量影响

3 结论

高地芽孢杆菌对叶瘟防效可达55%以上，对穗瘟防效则高达70%以上，对水稻纹枯病、稻曲病同样具有较高防效，对水稻生长及产量具有显著促进作用。表明筛选到的高地芽孢杆菌可能存在广谱抗病作用，是一类有潜力的生防细菌；在水稻绿色生产过程中，高地芽孢杆菌同样具有良好的推广应用价值。

4 讨论

有关高地芽孢杆菌用于植物生物防治的研究较少。目前报道了从辣椒根际土壤中筛选到B.altitudinis181-7 及ST15 能有效抑制水稻细菌性条斑生长[14-15]；张秀雨等[16]发现B.altitudinisD30202对十字花科杂草自生油菜的除草活性最为显著，同时对青稞、小麦表现出较高的安全性，可开发为禾本科作物田十字花科杂草的生物除草剂；靳西彪[17]从海洋中分离到的一株B.altitudinisZJ186，其发酵液对稻瘟病防效可达83.33%。本研究选用2 株高地芽孢杆菌，通过温室及田间试验发现其对稻瘟病有较高的生防效果，对叶瘟防效可达55%以上，穗瘟则高达70%以上，对水稻其他主要病害同样具有较高防效，由此推测2 株高地芽孢杆菌可能存在广谱抗病作用，是一类有潜力的生防细菌。前人研究发现，芽孢杆菌防治植物病害的机理主要包括产生脂肽类抗生素和拮抗蛋白2 类拮抗因子、对病原菌产生拮抗及诱导抗病性等[18]。本研究中涉及的2 株B.altitudinis对稻瘟病的防治机理有待进一步研究明确。

2 株B.altitudinis除可防治稻瘟病外，对水稻也具有显著促生作用。近年研究表明，微生物菌剂可直接提高植物对营养元素的吸收从而调节植物生长；还可利用其产生的抗菌活性成分或通过生态位和营养竞争等方式控制病原生物的生长繁殖从而间接促进植物增产[19-21]。杨华等[22]从水稻根围微生物中筛选到6 株在固氮或溶解有机和无机磷、钾或产铁载体和IAA综合水平较高的菌株，种子萌发率可提高25%～43%，根长增加18%～42%；刘泽平等[23]分析土壤中有效钾、有效磷的积累，发现B.megateriumLZP03、B.huizhouensisLZP05 和B.subtilisLZP06 促生能力较强，具有较强的开发利用潜力；B.altitudinisY1 可产生生长素和分解有机及无机磷，提高大豆株高和根长[24]。本研究中涉及的B.altitudinisJYW21及JYW26田间试验促进水稻株高差异不显著，但可显著提升其分蘖数、千粒重。B.altitudinisJYW21 可显著增加19.74%穗重，在促产方面JYW21表现更为突出。猜测B.altitudinisJYW21浸种处理对秧苗苗长及鲜重前期作用均不明显，可能是B.altitudinisJYW21 种子处理效果不如JYW26；在后期喷雾处理分蘖数及产量均显著高于JYW26，分析原因可能是产生了生长素、脱落酸、细胞分裂素等植物激素影响水稻组织中抗病相关防御酶、生长代谢相关蛋白等的表达，进而促进植物生长和增强抗逆能力，最终提高水稻植株抗病促生能力[25-27]。2 株高地芽孢杆菌可增加水稻叶片叶绿素的含量，这可能也是该菌促进水稻生长的原因之一[28]。