贲门癌组织FOXC1、SOX11表达及与病人临床病理特征和预后的关系

廖汉琪 唐羿 胡凯 姜耕

贲门癌是指发生在食管和胃交界线下约2 cm的范围内发生的癌症,其发病率呈逐年增高趋势[1]。早期贲门癌病人的首选治疗方式为手术治疗,然而部分中晚期病人肿瘤转移速度快,治疗效果和生存率均不理想[2]。因此,目前迫切需要深入了解贲门癌发生发展机制,同时需阐明贲门癌相关预后生物标志物。既往研究显示,叉头框C1(forkhead box C1,FOXC1)、性别决定区Y框蛋白(SRY-related HMG-box,SOX)11均与消化道肿瘤有密切联系,然而二者在贲门癌中的表达情况仍需进一步研究和探讨[3-4]。本研究主要通过对比分析贲门癌病人癌组织和癌旁正常组织中FOXC1、SOX11的表达变化,探讨二者表达与临床病理特征及预后的关系。

对象与方法

一、对象

收集本院2018年3月～2020年3月期间确诊的94例贲门癌病人癌组织标本、癌旁5 cm以上正常组织标本及相关临床资料。纳入标准:(1)病人为首次确诊,临床病理证实为贲门癌,符合美国国立综合癌症网络临床实践指南[5],所有病人均行腹腔镜近端胃切除+胃食管吻合术;(2)病人病例资料完整,均签署知情同意书;(3)研究通过本院临床伦理委员会审核。排除标准:(1)合并有其他恶性肿瘤;(2)心、肺、肾等脏器功能发生严重损伤;(3)合并有自身免疫性疾病、感染性疾病、血液系统疾病;(4)合并有其他胃肠道疾病。经纳入排除标准筛选后共纳入94例贲门癌病人,其中男性61例,女性33例,年龄35～78(60.12±10.35)岁,病人均进行内镜黏膜下剥离术。

二、方法

1.临床病理参数收集:收集贲门癌病人临床病理资料,主要包括年龄、性别、肿瘤直径、饮酒史、家族史、浸润深度、病理分期、组织分化程度、淋巴结转移。

2.免疫组化法检测正常组织和癌组织FOXC1、SOX11表达水平:采用免疫组化法检测组织中FOXC1(试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司,货号:IH-20573R)、SOX11(试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司,货号:XY9M-60624R)表达水平,用已知阳性病理切片作阳性对照,磷酸盐缓冲(phosphate buffer saline,PBS)溶液替代一抗作空白对照。将贲门癌病人癌组织及癌旁组织(距肿瘤边缘大于5 cm的正常组织)采用10%甲醛固定液浸泡固定后制成厚度3～5 μm的石蜡切片,切片经烘干、二甲苯脱蜡、水化、修复、一抗孵育、PBS冲洗、滴加二抗孵育、染色、固定后,封片显微镜下观察。两位专业人员采用双盲法阅片(每个切片均任意选5个高倍视野),阳性细胞比例评分包括0分、1分、2分、3分、4分,分别代表占比为0～4%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%。染色强度评分包括0分、1分、2分、3分,分别代表无着色、浅黄、棕黄、棕褐。以阳性细胞比例及染色强度评分乘积评估FOXC1、SOX11表达情况,积分为0～2分为阴性表达,≥3分为阳性表达[6]。

3.随访:病人治疗后接受为期3年的随访,随访时间为截止至2023年3月,随访的主要形式为电话随访、上门或门诊复查,随访终点为病人死亡或3年随访结束,期间94例病人均未失访。记录死亡病人人数并根据死亡情况分为生存组(54例)和死亡组(40例)。

三、统计学处理

采用SPSS 25.0统计学软件包进行统计学分析。计数资料采用例(%)表示并行χ2或配对χ2检验;采用Kaplan-Meier法分析贲门癌病人癌组织FOXC1、SOX11表达水平与3年生存率的关系;采用Cox风险回归模型分析贲门癌病人3年生存率的影响因素。双侧P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1.贲门癌病人正常组织和癌组织FOXC1、SOX11表达情况比较:贲门癌病人癌组织中FOXC1阳性表达率高于正常组织,SOX11阳性表达率低于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

A:正常组织中FOXC1阳性表达;B:癌组织中FOXC1阳性表达;C:正常组织中SOX11阳性表达;D:癌组织中SOX11阳性表达

表1 贲门癌病人癌旁正常组织和癌组织FOXC1、SOX11表达情况比较(例,%)

2.不同临床病理特征贲门癌病人癌组织FOXC1、SOX11表达水平差异:不同年龄、性别、肿瘤直径、饮酒史、家族史、浸润深度的贲门癌病人癌组织FOXC1、SOX11表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。病理分期Ⅲ+Ⅳ期、组织低分化、有淋巴结转移的贲门癌病人癌组织中FOXC1阳性表达率和SOX11阴性表达率显著高于病理分期Ⅰ+Ⅱ期、组织中/高分化、无淋巴结转移病人(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征贲门癌病人癌组织FOXC1、SOX11表达水平差异(例,%)

3.影响贲门癌病人3年生存率的单因素分析:死亡组与生存组年龄、性别、肿瘤直径、组织分化程度、饮酒史、家族史、浸润深度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。死亡组病理分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移、FOXC1阳性表达、SOX11阴性表达病人比例高于生存组(P<0.05)。见表3。

表3 影响贲门癌病人3年生存率的单因素分析(例,%)

4.贲门癌病人癌组织FOXC1、SOX11表达水平与3年生存率的关系:采用Kaplan-Meier法分析贲门癌病人癌组织FOXC1、SOX11表达与3年生存率的关系,结果显示,癌组织中FOXC1阳性表达病人3年总生存率(32/67,47.76%)低于FOXC1阴性表达病人(22/27,81.48%)(χ2=8.951,P<0.05);贲门癌病人癌组织中SOX11阴性表达病人3年生存率(27/61,44.26%)低于SOX11阳性表达病人(27/33,81.82%)(χ2=12.356,P<0.05)。见图2、图3。

图2 贲门癌病人癌组织FOXC1表达水平与3年生存率的关系

图3 贲门癌病人癌组织SOX11表达水平与3年生存率的关系

5.影响贲门癌病人预后的多因素Cox回归分析:以贲门癌病人3年随访期内是否死亡(是=1,否=0)为因变量,将FOXC1(阳性表达=1,阴性表达=0)、SOX11(阴性表达=1,阳性表达=0)、病理分期(Ⅲ+Ⅳ=1,Ⅰ+Ⅱ=0)、淋巴结转移(是=1,否=0)纳为自变量行多因素Cox回归分析,结果显示,FOXC1阴性表达是贲门癌病人死亡的独立危险因素,SOX11阴性表达是贲门癌病人死亡的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响贲门癌病人预后的多因素Cox回归分析

讨论

贲门癌的流行病学研究历来被认为是一个独立的学科方向,其发生发展涉及多阶段的病理改变,由遗传因素和环境因素共同作用[7]。贲门癌早期临床症状不典型,部分病人确诊时病情已发展为中晚期,导致失去最佳治疗时间,进而使病人生存率降低[2]。近年来癌症精准医学的发生较为迅速,生物靶向治疗在癌症治疗领域有重要临床意义[8]。为延长贲门癌病人生存时间,寻找新的生物治疗靶点已成为目前贲门癌的研究重点。

研究显示,FOXC1在结直肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤发生发展中均具有重要调控作用[9-10],但其具体功能复杂多样,因此FOXC1在贲门癌中的表达情况及相应功能仍需进一步分析。肿瘤是局部组织细胞出现控制紊乱的现象,当细胞自身控制紊乱时即表现出运动能力提高、血管新生、恶性增殖,进而形成恶性肿瘤,而其中细胞恶性增殖是肿瘤产生的必要条件[11-12]。Lin等[13]研究表明,FOXC1可促进肝癌细胞增殖和转移。吴军等[14]研究显示,FOXC1与胃癌细胞增殖能力升高、凋亡率下降有关,其在胃癌组织中表达上调。本研究结果同样显示FOXC1在贲门癌病人癌组织中表达上调。基于既往研究推测FOXC1表达上调可能通过促进贲门癌细胞的恶性增殖,推动疾病进展。此外,本研究结果中FOXC1与病人临床病理特征病理分期、组织分化程度、淋巴结转移相关,FOXC1高表达病人3年死亡率高。Sun等[15]研究发现,FOXC1过表达可增强胃癌细胞的上皮间质转化,激活细胞迁移和侵袭。进一步推测,FOXC1高表达亦可能通过促进贲门癌细胞的迁移和侵袭,促进癌细胞转移,不利于病人预后。

SOX家族编码的蛋白是一类具有重要功能的转录调控蛋白,早期研究主要集中于组织分化和胚胎发育,目前发现其在癌症中同样具有重要作用[16]。Yeh等[17]研究证实,SOX11基因rs77996007位点多态性参与口腔癌症的进展和临床特征。既往研究显示,异常的DNA甲基化,特别是抑癌基因的高甲基化,是公认的肿瘤初始发生阶段的生物标志物[18]。Sun等[19]研究表明,SOX11在胃癌组织中通过高甲基化下调,且其甲基化显著增加了胃癌风险。本研究发现,贲门癌病人癌组织中SOX11低表达,且其低表达与分期增加、组织低分化及淋巴结转移相关。基于既往研究推测SOX11在贲门癌组织中可能同样通过高甲基化表达下调,其表达下调可能通过促进肿瘤细胞恶性进展推动贲门癌疾病进展,增加不良预后的发生风险,其具体作用机制有待进一步基础研究证实。

综上,贲门癌病人癌组织中FOXC1高表达,SOX11低表达,二者与病理分期、组织分化程度及淋巴结转移密切相关,且是影响贲门癌病人死亡的重要危险因素。本研究可为贲门癌的防治提供参考,今后可将FOXC1、SOX11作为治疗靶点进一步的研究和探讨,利用基础研究证实二者在疾病进展中发挥的关键作用机制。同时今后将进行前瞻性的大样本研究进一步证实FOXC1、SOX11在贲门癌病人预后中的预测价值。