索拉菲尼诱导的细胞凋亡和自噬对HeLa细胞耐药性的影响

杨铠菲，朱静格，张洋洋，赵俊果，高雨悦，胡焕焕，2*，姬国杰

新乡医学院三全学院1.生命科学技术学院；2.生育力保存重点实验室；3.生物与基础医学实验教学中心，河南 新乡 453000

宫颈癌是世界范围内对女性危害严重的第4大恶性肿瘤,主要发病于发展中国家和欠发达国家[1]。凋亡的特征是常见的形态学和生化改变[2],多数化疗药物都是通过诱导细胞凋亡发挥其抗癌活性,细胞产生耐药性可能与细胞凋亡作用相关[3]。然而,由于外界药物的刺激,细胞启动一种自我保护的机制——细胞自噬。细胞自噬是一个严格受基因调控的过程,细胞自噬作用在细胞更新和增殖分化过程中都起着作用[4]。自噬与肿瘤密切相关[5],研究表明,细胞自噬作用对宫颈癌细胞药物敏感性也有一定影响[6]。同种药物在不同的细胞中对细胞自噬和细胞凋亡有着不同的影响,更好的理解细胞凋亡和细胞自噬的关系有助于肿瘤药物的研发与肿瘤治疗。

Bcl-2蛋白家族成员可以与自噬相关蛋白Beclin1结合从而直接抑制细胞自噬。凋亡途径的完整性在Bcl-2家族对于自噬的抑制中起重要作用,当Bax和Bak被敲除时,细胞中固有的凋亡途径也会失去功能,Bcl-2家族也就失去抑制细胞自噬的功能[7]。在肝癌细胞中,自噬对于肿瘤细胞的增殖表现出抑制作用[8]。药物对细胞凋亡和自噬的影响在不同的细胞中显示出不同的作用,有相关研究指出自噬促进了肿瘤细胞的凋亡[9]。

目前的大量研究证明索拉菲尼(sorafenib)在多种肿瘤如肝癌[10]、结肠癌[11]、黑色素瘤[12]、宫颈癌HeLa细胞[13-14]中都具有有效性。近年来,也有各种有关提高索拉菲尼的靶向性和治疗效果的研究[15]。在某些细胞中(如白血病)索拉菲尼可独立于RAF/MEK/ERK抑制诱导细胞凋亡[16-17],索拉菲尼介导的人类白血病细胞的杀伤力作用与内质网应激的诱导以及抑制翻译导致的抗凋亡蛋白髓样细胞白血病(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)下调有关,但在人类白血病细胞中,使用合适浓度索拉菲尼在细胞内质网发生氧化应激,可以有效的灭活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases 1,ERK1)[17]。

本研究主要针对索拉菲尼如何通过细胞凋亡和细胞自噬影响HeLa细胞增殖,以及细胞凋亡和细胞自噬之间的关系和细胞自噬与HeLa细胞耐药性的关系来进行研究。在了解细胞自噬和细胞凋亡之间关系的同时,为宫颈癌治疗的联合用药以及新药的开发提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌HeLa细胞系(购买自湖南丰晖生物科技有限公司)。Gibco胎牛血清、2.5%胰蛋白酶(10×)、台盼蓝染液(0.4%)、索拉菲尼、RPMI 1640培养基(北京索莱宝生物科技有限公司);CCK-8试剂、PBS(10×)、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);二甲基亚砜(DMSO)(Sigma Aldrich公司);TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) ver3.0试剂盒(宝日医生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 体外细胞培养:在37 ℃、5% CO2的培养条件下,保证温度和湿度,用含10% FBS的RPMI 1640培养基中进行培养。待细胞生长达到80%～90%汇合时,使用0.25%的胰蛋白酶进行消化传代。取生长状态良好的细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT法检测索拉菲尼的IC50值:将对数生长期细胞制成浓度为3×104cells/mL的单细胞悬液,向各孔加入100 μL细胞悬液;待细胞贴壁后,换不同浓度加药培养基(每个浓度做6个重复),放入恒温培养箱继续培养24 h;24 h后,用5 mL针管吸出加药培养基,用0.9%氯化钠溶液洗1～2次,再向每孔加入10 μl 5 mg/mL MTT溶液,在恒温培养箱继续培养4 h;用5 mL针管吸去MTT溶液,向每孔加150 μl DMSO,在室温将96孔板在黑暗状态下震荡10 min,570 nm下测定吸光值,计算索拉菲尼对HeLa细胞抑制率及IC50值。

1.2.3 建立细胞耐药株:用间歇诱导法构建耐药细胞株[18],以0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μmol/L为梯度的索拉菲尼处理HeLa细胞,每个浓度维持1周,并筛选出可稳定传代的耐药细胞株,然后用常规培养基稳定耐药细胞株,最后维持在含索拉菲尼药物的培养液中。

1.2.4 流式细胞测量术检测细胞增殖周期:在MTT法测定细胞增殖活性后,用无血清培养基培养HeLa细胞24 h,选用合适浓度的索拉菲尼处理HeLa细胞。将细胞收集在1.5 mL 离心管中,用0.9%氯化钠溶液洗涤细胞3次,离心之后弃去上层清液,以200 μL生理盐水重悬细胞,再将800 μL乙醇加入离心管,固定-20 ℃过夜;低速离心机离心,用1mL低渗溶液,在37 ℃孵箱中放置30 min;再进行离心,加入1mL PI溶液(50 μg/mL),放入冰水混合物30 min;用流式细胞仪测定荧光染料激发后PI-DNA复合物发出的荧光,用ModFit3.2进行细胞周期各阶段的量化。

1.2.5 总RNA提取和PCR检测:TRIzol法提取细胞的总RNA,将样品进行反转录反应,以反转录得到的cDNA为模板用PCR试剂盒说明书进行实验,以GAPDH为内参。取10 μL Taq mix(Taq+dNTP)、6 μL H2O、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL Sample混合为20 μL总体系,放入PCR仪,设定程序,PCR扩增结束,进行电泳,对电泳图进行灰度值分析,进而分析实验结果。

1.2.6 Western blot检测蛋白质表达:HeLa细胞中加适量细胞裂解液,冰上裂解30 min;于4 ℃下12 000 rpm离心5 min,保留上清,使用BCA蛋白质定量试剂盒测定样品蛋白质浓度并进行定量。取20 μL样品进行SDS-PAGE电泳分离,设置90 V电泳30 min,达到分离胶后调整电压为120 V,待其达到末端停止电泳。使用电泳槽湿转1 h,将样品转移至 PVDF膜,再用5%脱脂奶粉在37 ℃孵箱中封闭0.5 h。取出膜,进行一抗孵育,放置于4 ℃冰箱过夜。之后用HRP二抗,在室温状态下孵育1 h,最后在凝胶成像系统中进行曝光,进行灰度值分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HeLa细胞耐药株的构建

以间歇诱导法构建耐药细胞株,最终筛选出的索拉菲尼IC50浓度为16.992 μmol/L。亲本株:细胞多为圆形;耐药株:在细胞进行耐药诱导之后,多为不规则形状,且细胞体积增大(图1)。

A.parental cell strain; B.drug-resistant strains of sorafenib.

2.2 MTT法测定细胞增殖

MTT结果显示,随着药物浓度的增加,细胞活力逐渐下降且亲本株下降较为明显(图2)。同时,索拉菲尼药物对亲本细胞有更高的抑制率,说明索拉菲尼药物对细胞的增殖具有抑制作用,并且对亲本细胞株的抑制作用更加显著(P<0.05),而耐药细胞株则具有更强的增殖能力(图3)。

图2 细胞活性比较Fig 2 Comparison of cell viability in each group

图3 细胞增殖情况比较Fig 3 Comparison of cell proliferation curves in each

2.3 流式细胞术检测细胞周期

流式检测结果显示,加药组G0/G1期细胞数量显著升高(图4)。耐药细胞株在G0/G1期发生细胞周期阻滞,在G1期细胞有明显数量增加。说明索拉菲尼是通过阻滞细胞周期来抑制细胞增殖(图5)。

A.control group; B.sorafenib group; C.cell quantification map of each stage; *P<0.05 compared with control group.

A.parental strain; B.drug-resistant strain; C.cell quantification map of each stage; *P<0.05 compared with parental group.

2.4 目标mRNA表达量在亲本株和耐药株中的测定

PCR结果显示, 经索拉菲尼处理的细胞耐药基因表达量相对升高,凋亡基因与凋亡抑制基因也相对升高,但凋亡基因升高更为显著(P<0.05)(图6)。在15 μmol/L之前,细胞凋亡起促进作用,在15 μmol/L之后,细胞凋亡被抑制(图7)。

A.parental group; B.drug-resistant strain group; *P<0.05 compared with 0 μmol/L group.

*P<0.05 compared with control group.

2.5 自噬标志物蛋白在亲本和耐药细胞的表达情况

LC3有两种亚型分别为LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,常被作为检测细胞自噬的标志,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值被用来判定细胞自噬程度的高低。Western blot结果显示,耐药细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值显著高于亲本细胞,表明索拉菲尼会诱导细胞LCs的自噬水平升高(图8)。

*P<0.05 compared with parental strain.

3 讨论

近几年来,宫颈癌被称为危害女性生殖功能的恶性肿瘤之一,迄今仍缺乏有效的治疗手段,一方面因为错综复杂的病理因素,另一方面因为服药一段时间后肿瘤出现耐药性。近几年的研究认为细胞自噬是肿瘤细胞出现耐药性的原因之一,但目前对细胞凋亡与自噬对肿瘤增殖作用的影响仍存在争议,高水平的自噬伴随caspase家族蛋白的低表达[19]。所以,一定程度上细胞自噬与细胞凋亡呈现负相关, 促进肿瘤细胞的存活; 外界药物的刺激在引起细胞自噬,自噬相关蛋白作为caspase家族蛋白的底物,轻微的下调caspase蛋白活性,调控细胞凋亡,这时细胞自噬与肿瘤细胞的耐药性呈现正相关。由于细胞自噬在一定程度上引起细胞死亡,如果药物的刺激对肿瘤细胞的刺激较大,这时细胞自噬与细胞耐药性呈现出负相关,即自噬促进肿瘤细胞的死亡。所以,细胞凋亡和细胞自噬对于肿瘤细胞都存在拮抗效应,只是在不同的时期发挥的主效应不同,若细胞凋亡大于细胞自噬所发挥的效应,自噬就引起细胞的耐药性;若细胞自噬大于细胞凋亡所发挥的效应,自噬就会促进细胞死亡。所以,探索细胞凋亡和细胞自噬的界限有助于更好的理解药物对肿瘤细胞增殖的影响。在了解细胞自噬和细胞凋亡之间关系的同时,为宫颈癌治疗的联合用药以及新药的开发提供指导。

综上所述,药物索拉菲尼通过阻滞细胞周期来达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。细胞自噬一方面参与了细胞耐药的发展,促进细胞存活;另一方面,在一定的限度上,也能激活耐药细胞的凋亡信号通路,促进细胞耐药逆转。随着对自噬和凋亡界限研究的不断深入,以及科学技术的不断发展,相信未来在宫颈癌的治疗方面将会取得重大进展。