不同葡萄品种灰霉病抗性鉴定及褪黑素抗病机理初探

王宪璞 代瑛姿 郭宏扬 杨志峰 许丽丽

（石河子大学农学院，特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子 832003）

葡萄（VitisViniferaL.）是世界四大水果之一，也是重要的经济作物，栽培面积和产量逐年递增，截至2022 年，我国葡萄栽培面积位居世界第三［1］。随着栽培面积的不断扩大，葡萄病害日益严重，其中灰霉病是严重危害我国葡萄产业的主要病害之一，病原菌可侵染葡萄全株，造成大量减产，严重威胁果农收益［2］。

葡萄种质资源大致可分为东亚种群、美洲种群、欧洲种群和特殊类型的圆叶种群［3］，其中东亚种群灰霉病抗性较强，尤其以中国野生葡萄种质资源抗性最高［4］，其次是美洲种群和圆叶种群，欧洲种群抗性最低，欧亚杂交种抗性居于欧洲种群与美洲种群之间。Gabler 等［5］对102 个葡萄品种果实接种灰霉病病原菌（Botrytiscinerea）后发现，仅11 个品种对灰霉菌表现为高抗，除皇帝和秋黑表现中等抗性外，其余欧洲葡萄品种均易感病。任志华等［6］对31 个葡萄品种叶片进行灰霉病抗性鉴定，其中欧亚种左优红等抗性较强，欧洲品种无核白鸡心等抗性较差。Rahman 等［7］接种了81 个葡萄品种叶片，发现雷司令和黑比诺表现高感，火焰无核表现感病，刺葡萄紫秋和巨玫瑰表现高抗。

目前，葡萄灰霉病防治多以化学手段为主，如喷施杀菌剂咯菌腈、唑醚·氟酰胺和寡雄腐霉等，具有操作简便和高效经济的特点。然而，长期使用化学药剂严重威胁着果园生态环境和食品安全，随着病原菌发生耐药性变异，杀菌剂滥用问题也日益严峻。近年来有研究表明，果实内源次生代谢活性物质（如苯丙素、白藜芦醇和木质素）可以激活植物防御信号通路，抵抗病原菌侵染，但其防治效果受多方面因素影响，目前仍处于研究利用的初期阶段［8］。褪黑素（melatonin，MT）于1958 年在牛松果腺中被发现，又名美拉酮宁、抑黑素、松果腺素，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺（N-acetyl-5-methoxytryptamine）［9］。近年来，MT 在生物胁迫中的作用受到广泛关注。例如用不同浓度MT灌溉苹果根系，提高了其抗褐斑病能力［10］；MT 处理诱导了拟南芥（烟草）致病相关基因的表达，暗示了MT是植物体防御病原体的信号分子［11-13］。此外，MT能诱导依赖水杨酸（salicylic acid，SA）和乙烯的相关基因的表达［14］，通过茉莉酸（jasmonic acid，JA）、乙烯和一氧化氮信号途径，协调合作抵抗病原菌［15-16］。但目前，有关MT 调控葡萄灰霉病抗性的研究报道较少，关键抗性机理尚不明确。

因此，本研究以10 个新疆主栽葡萄品种为试材，分别在果实及叶片中接种葡萄灰霉病病原菌Botrytis cinerea，通过病情严重度与综合指标评价其灰霉病抗性；通过施用外源褪黑素研究总酚等次生代谢物在褪黑素诱导葡萄果实抗灰霉病中的作用。研究旨在揭示褪黑素提高葡萄对灰霉病菌抗性的生理机制，从而为褪黑素提高葡萄抗灰霉病的田间应用提供数据支撑，也为发掘、利用优质抗病种质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灰葡萄孢菌株为西北农林科技大学葡萄酒学院惠赠。供试材料取自新疆主栽葡萄品种。参试叶片来自两年生盆栽葡萄扦插苗，待植株具20 片功能叶时喷施孢子悬浮液。参试果实取自5 年生露地篱架式葡萄，待果实完全成熟后喷施孢子悬浮液。参试葡萄品种及其遗传背景见表1。

表1 参试葡萄品种信息表Table 1 Information of grape variety tested

1.2 材料处理

将活化的B.cinerea接种在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养皿中，22 ℃恒温暗培养7 d，用无菌水冲洗培养基，无菌脱脂棉过滤后收集孢子悬浮液，室温储藏（当天使用）。将孢子悬浮液均匀喷施在参试葡萄叶片上，直至叶片表面见水珠滴下，每个品种设置10 株重复；对照为相同体积无菌水，处理方式同上。每隔5 d处理一次，15 d后采集叶片样品进行抗性理化指标测定。

采集距新梢顶端性状一致、长势良好且无病虫害的3～5 片叶，无菌水冲洗后吸干多余水分，使用经B.cinerea孢子悬浮液湿润的脱脂棉处理叶片阳面。各参试品种试验组及对照组均随机选取2片性状一致的叶片，每2 d处理一次，采用十字交叉法测量病斑直径并计算病斑面积大小。每个处理组设置3个生物学重复。

随机采集成熟期葡萄果穗进行室内离体侵染试验，处理方式同上。每个品种设置10穗重复。

1.3 测定方法

1.3.1 叶片指标测定 目视法观察叶片绒毛覆盖率；YMJ-A型叶面积仪（山东恒美电子科技有限公司）测定叶片叶面积；480-505D型数显外径千分尺（桂林量具刃具有限责任公司）测量叶片厚度；称重法计算叶片相对含水量：样品相对含水量=（鲜重-干重）/鲜重×100%；HM-YA型叶绿素测定仪（山东恒美电子科技有限公司）测定叶片叶绿素含量；蜡质含量测定参考Jetter 等［17］的方法；叶片电导率测定参照赵世杰等［18］的方法；丙二醛含量测定采用试剂盒法（索莱宝，北京）。

1.3.2 果实指标测定 DS-303P型电子天平（厦门金河源科技有限公司）测量葡萄果实单果重；AK002B 型手持式糖度仪（深圳测友科技有限公司）测定可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量；LX-A 型水果硬度计（温州韦度量具仪器有限公司）测定果实硬度；果实果胶含量测定参考马丽等［19］的方法；总酚含量和活性氧清除酶类活性测定采用试剂盒法（索莱宝，北京）。

1.3.3 基因表达水平鉴定 采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）鉴定基因表达水平。使用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit 试剂盒（RC401，诺唯赞，南京）提取葡萄总RNA；使用HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR（R323，诺唯赞，南京）合成cDNA 第一链；利用Primer 5.0 软件设计特异性定量引物，以β-Actin作为内参基因；数据分析采用2-ΔΔCT法。qRT-PCR引物序列见表2。

表2 抗氧化酶基因引物序列Table2 Primers of the related genes of antioxidants enzymes

1.3.4 灰霉病抗性综合评价 利用模糊数学中隶属函数的方法，采用公式（1）进行原始数据转化［20］，使用SPSS 27.0 软件进行因子分析；采用公式（2）计算各综合指标的权重；采用公式（3）计算各葡萄品种综合抗病能力得分：

Uij表示i品种j指标的灰霉病抗性隶属函数值，Xij表示i品种j指标的综合系数，Xjmax表示所有品种中j指标的最大值，Xjmin表示所有品种中j指标的最小值，i表示某个葡萄品种，j表示某个抗性指标［21］。

Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度，Pj为各品种第j个综合指标的贡献率。

D为各品种灰霉病抗性综合评价值。

1.4 数据处理

参考Tantasawat 等［22］的方法，利用公式（4）计算病情严重度（disease severity，DS）：

依据DS 水平设定葡萄灰霉病抗性分级标准：DS=0 代表免疫；0＜DS≤5%代表高抗类型（high resistance，HR）；5%＜DS≤15%代表抗病类型（resistance，R）；15%＜DS≤45%代表中抗类型（moderate resistance，MR）；45%＜DS≤75%代表感病类型（susceptible，S）；75%＜DS 代表高感类型（high susceptible，HS）。

设置3 次生物学重复。利用SPSS 24.0 进行相关性分析、隶属函数分析和单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），显著性水平为0.05，使用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同葡萄品种叶片与果实性状指标测定

10 个葡萄品种基本性状测定结果表明，除巨峰、葡之梦和阳光玫瑰叶片有绒毛之外，其他均无绒毛覆盖；参试葡萄品种叶片面积为51.00～116.87 cm2，其中黄金蜜叶面积最大，巨盛一号最小；叶片相对含水量、蜡质含量及叶绿素含量分别为66.97%～71.73%、1.31～2.32 mg·g-1和1.00～2.46 mg·g-1，其中叶片含水量种间差异不显著，巨峰葡萄叶片蜡质含量显著高于黄金蜜，为2.32 mg·g-1，黄金蜜葡萄叶片蜡质与叶绿素含量均低于其他品种；果实单果重种间差异较大，其中巨盛一号、巨峰、美人指葡萄单果重达12.13、11.76和11.40 g，显著高于其他品种；巨峰葡萄果实可溶性固形物、硬度与果胶含量低于其他品种，为16.81%、3.17 kg·cm-1和0.57 mg·g-1（表3）。

表3 不同葡萄品种叶片与果实基本性状Table 3 Trait index of leaves and fruits in different grape cultivars

2.2 不同葡萄品种灰霉病抗性水平鉴定

接种B.Cinerea10 d 后，多数参试品种果实和叶片均发生不同程度褐变，抗性水平差异显著（表4、5）。巨峰和巨盛一号葡萄病情严重度均未达15%，接种10 d 后，果实病情严重度分别为12.68%和8.94%，叶片病情严重度分别为6.00%和12.00%，均属抗病类型；黄金蜜、葡之梦、夏黑、美人指、维多利亚接种后表现较稳定，第10 天果实病情严重度分别为31.12%、32.16%、24.80%、34.37%、32.71%，叶片病情严重度分别为30.00%、14.00%、25.33%、24.00%、25.33%，除葡之梦叶片表现为抗病类型外其他均表现为中抗类型；阳光玫瑰、克瑞森和蓝宝石在灰霉菌孢子悬浮液处理10 d 后，除蓝宝石果实病情严重度为36.17%，表现为中抗类型外，其叶片和其他品种的果实、叶片的病情严重度均大于50%，表现为感病类型。

表5 不同品种葡萄果实灰霉病抗性类型Table 5 Resistance classification of different grape varieties to Botrytis cinerea

2.3 不同葡萄品种灰霉病抗性综合评价

为探究不同葡萄品种叶片和果实基本性状及接种10 d 后病情严重度（采用数值的相反数表示抗性）之间的相关性，采用隶属函数对参试葡萄品种综合抗性赋分，综合评价其灰霉病抗性。对不同葡萄品种12个相互关联的单项指标进行主成分分析和变量因子分析，结果表明，叶片面积与叶片蜡质含量和单果重显著负相关；叶片绒毛覆盖率与蜡质含量显著正相关，与葡萄果实果胶含量显著负相关；叶片厚度与蜡质含量及叶绿素含量显著正相关；叶片蜡质含量与叶绿素含量呈显著正相关，而与果胶含量显著负相关；叶片病情严重度负数与果实病情严重度负数显著正相关（表6）。前4 个综合评价指标的累计贡献率高达87.895%，综合指标贡献率分别为48.326%、16.989%、12.834%和9.746%（表7）；计算各葡萄品种综合指标隶属函数值、权重及综合得分，其中巨峰的D值最大，而白色葡萄黄金蜜与红色葡萄克瑞森的D值仅为0.10 和0.14，说明两者综合抗性最弱（表8）。

表6 不同葡萄品种各个指标之间的相关性分析Table 6 Correlation analysis of various indicators of different grape varieties

表7 不同葡萄品种主要指标特征值、贡献率及综合权重分析Table 7 Analysis of characteristic value，contribution rate and comprehensive weight of main indexes of different grape varieties

表8 不同葡萄品种的综合系数、隶属函数值、D值Table 8 Comprehensive index，membership funcition value，D value of different grape varieties

2.4 B.cinerea侵染对不同葡萄品种叶片相对电导率的影响

由以上隶属函数分析可知，10个葡萄品种主要指标特征值均为叶片的性状指标，因此测定B.cinerea侵染前后葡萄叶片中渗透调节物质含量的变化可为进一步反映B.cinerea对葡萄生理功能的影响。由图1-A可知，B.cinerea未侵染叶片时，所有葡萄品种叶片相对电导率最高为0.78，最低为0.70，B.cinerea侵染叶片后，不同抗性品种的叶片相对电导率均出现了不同程度的增长，其中维多利亚葡萄叶片相对电导率增加了16.21%，差异达极显著水平，阳光玫瑰、葡之梦、克瑞森差异达显著水平，其他参试品种差异不显著。B.cinerea侵染葡萄叶片，造成所有葡萄品种叶片中超氧阴离子产生速率程现不同程度的增加（图1-B）。仅葡之梦、阳光玫瑰、克瑞森和蓝宝石在灰葡萄孢侵染后表现出与对照组相比差异极显著，其叶片中产生速率分别为30.43、34.47、34.48和33.82 nmol·min-1·g-1，而巨峰葡萄叶片中产生速率无显著差异。同样在B.cinerea侵染葡萄叶片后，所有葡萄品种叶片中丙二醛含量均增加，其中，阳光玫瑰和克瑞森葡萄叶片丙二醛含量分别增加了146.09%和172.45%，而巨峰、夏黑和维多利亚葡萄叶片丙二醛含量分别增加了22.28%、22.24%和30.02%，与对照组相比无显著差异，其余参试品种与对照组相比，叶片丙二醛含量差异均达极显著水平（图1-C）。

图1 不同品种葡萄品种叶片电导率等含量测定Fig.1 Determination of electrical conductivity and other contents in grape leaves of different varieties

B.cinerea未侵染葡萄叶片时，巨峰葡萄叶片中游离脯氨酸含量为49.77 μg·g-1，在所有品种叶片中含量最高，且在B.cinerea侵染后，其含量增加至57.28 μg·g-1，同样高于其他品种。除维多利亚葡萄叶片中游离脯氨酸含量侵染前后无显著差异外，其他所有品种叶片均有显著或极显著性差异（图1-D）。

2.5 外源MT 对巨峰和克瑞森葡萄B.cinerea 抗性的影响

为了探索B.cinerea感染后，巨峰和克瑞森葡萄果实多酚等氧化物质代谢的变化及外源MT 抵御B.cinerea侵染的作用，测定了葡萄总酚含量、总抗氧化能力、苯丙氨酸淀粉酶和多酚氧化酶活性（表9）。结果表明，接种B.cinerea10 d 后，巨峰和克瑞森葡萄果实4 项指标分别降低了60.27%、47.20%、54.00%、62.43%和15.83%、51.24%、17.04%、48.94%，且指标水平在接种B.cinerea前后差异显著。

表9 葡萄果实总酚含量、总抗氧化能力、多酚氧化酶、苯丙氨酸解胺酶活性测定Table 9 Content of total phenols，total antioxidant capacity，phenylalanine amylase and polyphenol oxidase activity in grapes

与B.cinerea侵染10 d 的果实相比，外源MT 总体上提高了B.cinerea侵染10天后果实的总抗氧化能力、苯丙氨酸淀粉酶和多酚氧化酶活性。与对照相比，MT缓解了B.cinerea对果实的伤害，巨峰葡萄果实总酚、总抗氧化能力、苯丙氨酸淀粉酶活性分别增加了11.11%、23.73%和39.39%，呈显著差异，克瑞森果实经MT 处理后，总酚、多酚氧化酶、苯丙氨酸淀粉酶活性分别增加了195.32%、89.03%和34.55%（表9）。

2.6 外源MT对B.cinerea侵染后葡萄果实VvCu/Zn-SOD1a等基因表达量的影响

为进一步探究外源MT 对受B.cinerea侵染果实活性氧清除相关基因表达水平的影响，通过qRT-PCR技术并分别检测了B.cinerea处理0 d、10 d 及MT+B.cinerea处理10 d 后果实VvCu/Zn-SOD1a等基因的表达水平。

巨峰和克瑞森葡萄在受B.cinerea侵染10 d后，果实VvCu/Zn-SOD1a等基因表达量均显著或极显著降低，而在外源MT+B.cinerea处理后，所有基因表达水平又有所升高（图2）。其中B.cinerea处理10 d后，巨峰和克瑞森葡萄果实中VvCu/Zn-SOD1a基因表达量下降幅度最大，分别降低96.86%和97.02%；B.cinerea浸染的巨峰和克瑞森葡萄果实经外源MT 处理后，VvCu/Zn-SOD1a基因表达量显著上调，分别升高了378.85%和1 383.60%，与B.cinerea处理差异显著。B.cinerea处理10 d后，两个葡萄果实中VvPPO和VvPAL1的表达量分别降低81.75%、68.45%和83.28%、94.58%，MT+B.cinerea处理下VvPAL1基因表达量较前处理差异显著，分别升高134.83%和82.22%。葡萄花青素合成通路中关键酶合成基因VvCHS3基因表达量下降幅度最小，在两个葡萄品种中分别降低26.59%和59.18%，添加MT 后其表达量又分别升高12.65%和46.39%，除巨峰果实中VvCHS3 和VvPPO在B.cinerea浸染下后经MT处理的表达量差异不显著外，其他均差异显著或极显著。

图2 外源MT对B.cinerea感染10 d后巨峰和克瑞森葡萄活性氧清除相关基因表达水平的影响Fig.2 Effect of exogenous MT on the expression of active oxygen removing related genes in Kyoho and Crimson grape which infected with B.cinerea for 10 days

3 讨论

3.1 葡萄种间灰霉病抗性差异

葡萄灰霉病抗性多受遗传因素影响，属多基因控制的数量性状，群体间差异显著。本研究发现，部分新疆主栽品种灰霉病抗性差异显著，结合隶属函数进行多表型综合评价发现，欧美种葡萄抗性强于欧亚种，并以巨峰葡萄抗性最强，黄金蜜葡萄抗性最弱。田园园［23］结合病原菌侵染前后叶片、果实灰霉病抗性鉴定及防御酶活性、信号分子含量变化趋势，分别对23 份葡萄品种（优系）进行了灰霉病抗性评价，其中以欧美种的巨峰优系葡萄抗性最强，感病品种以克瑞森、红地球葡萄等欧亚种居多；任志华［24］通过叶片接种表型鉴定和显微结构观察，对31 个葡萄品种以及杂交后代群体进行了灰霉病抗性鉴定，发现欧美种葡萄对灰霉病抗性表现抗病，而欧亚种葡萄普遍表现感病，与本研究观点基本一致。Hou等［25］研究发现葡萄品种双优对葡萄灰霉病的抗性较高，而红地球葡萄对葡萄灰霉病的抗性较低，提出不同葡萄品种对灰霉病菌感染的抵抗力受不同的基因型影响。

3.2 灰霉病诱导植物细胞膜透性升高，渗透调节物质积累

细胞膜透性是反映细胞膜损伤的主要指标之一［26］，而植株电导率在一定程度上反映了植物细胞膜透性受逆境伤害的程度［27］，可作为葡萄品种抗灰霉病特性的重要指标之一。本研究中葡之梦、阳光玫瑰、克瑞森和维多利亚经过灰霉病菌处理之后，植物叶片电导率出现显著或极显著变化，细胞膜透性显著提高，而巨峰、夏黑、巨盛一号在处理前后膜透性变化不显著，由此说明葡萄品种抗病性越弱，植物电导率变化越显著。丙二醛（MDA）是植物细胞膜脂过氧化的重要产物，逆境胁迫导致植物活性氧水平升高，引起膜脂过氧化，造成MDA 积累，MDA 水平可直接反映逆境伤害的程度［28］。本研究发现，经过病菌接种试验，所有葡萄品种叶片中MDA 含量全部增加，其中阳光玫瑰和克瑞森等葡萄叶片MDA 含量显著增加，而巨峰、夏黑、维多利亚等抗病葡萄叶片MDA 含量与对照组相比无显著差异。这可能是病害胁迫下细胞膜破坏产生，从而导致叶片MDA 积累所致。B.cinerea侵染导致植物叶片组织内活性氧水平升高，其产生速率受病害胁迫程度和时间的影响。以上3 个指标均与抗性程负相关性，而在逆境条件下，植物体内渗透调节物质游离脯氨酸含量显著增加，抗性强的品种往往积累较多的脯氨酸。由图1 可知，B.cinerea侵染后，大部分葡萄品种叶片MDA 和游离脯氨酸含量显著或极显著上调，而相对电导率及产生速率仅在个别葡萄品种叶片中出现差异。Govrin 等［29］指出，病害和许多其他胁迫都会导致活性氧生产，对植物叶片细胞膜产生伤害。这意味着B.cinerea在侵染感病葡萄如阳光玫瑰、克瑞森叶片时，极易破坏其细胞膜透性，造成离子失衡、MDA 迅速积累、产生速率升高，打破细胞内部氧化还原平衡状态，加快细胞死亡，而抗病葡萄叶片如巨峰等则在细胞组织中积累较多的游离脯氨酸，可以很好地缓冲由B.cinerea侵染引起的细胞内外渗透压不平衡。

3.3 MT通过调控活性氧平衡缓解B.cinerea对葡萄的危害

病原菌侵染后通过激活宿主细胞免疫抗性响应，诱导活性氧（ROS）大量积累，ROS 代谢失衡则对细胞膜系统造成严重损伤，MT的重要的特性是它的抗氧化活性，即通过清除细胞产生的多余自由基，增强抗氧化能力，从而提高植株的抗逆性［30-31］。本研究表明，MT可缓解B.cinerea对葡萄果实的胁迫：B.cinerea侵染后，葡萄果实总酚含量骤减，且抗氧化酶相关基因Cu/Zn-SOD1a、VvPPO等表达量也显著或极显著下调，而外源MT处理后，除巨峰葡萄VvCH3和VvPPO表达量无显著差异，其他活性氧清除相关基因表达量均有不同程度上调（图2），表明外源MT 可以降低生物胁迫下植物体内过氧化物含量的积累，缓解细胞膜脂过氧化。Mirshekari 等［21］也证实MT 处理可以调控超氧化物酶等抗氧化酶活性，进而降低ROS 的积累。上述研究均表明，MT可以提高葡萄植株内总酚含量、抗氧化酶，从而清除植物体内由生物胁迫产生的自由基，提高葡萄对灰霉病的抗性。

葡萄防御关键基因VvPAL1、VvPPO可通过诱导苯丙烷代谢相关酶的活性，促进类黄酮，酚类和木质素等抗真菌化合物的积累，提高果实病抗性水平。Xu等［32］研究表明，葡萄受病原菌TalaromycesrugulosusO1侵染后PPO 和PAL 活性上升，提高了对病原菌的抗性。尽管本研究发现B.cinerea侵染10 d 后，VvPAL1、VvPPO活性显著降低、表达水平显著或极显著降低，经外源MT 处理后两种防御酶活性有一定程度提高，增强了葡萄对病原菌的抗性。T.rugulosus与B.cinerea侵染前后，VvPPO 和VvPAL 活性变化趋势存在差异，这可能与两种病原菌致病机理和侵染时期有关。

4 结论

本研究明确了10 个新疆主栽葡萄品种的灰霉病抗性水平，揭示了MT 调控葡萄灰霉病抗性的生理基础。部分葡萄品种灰霉病抗性差异显著，其中以巨峰葡萄抗性最强，黄金蜜葡萄抗性最弱。B.cinerea诱导葡萄细胞膜透性升高，渗透调节物质积累。MT可通过抑制植物体内过氧化物含量的积累，缓解细胞膜脂过氧化，进而提高葡萄灰霉病抗性。