基于Notch信号通路探讨芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病大鼠Th1/Th2免疫平衡的调节机制＊

马若飞，苏 苗，李金田，2＊＊，李 娟，张 毅，徐韦玮，姜佳辰

（1.甘肃中医药大学中医临床学院 兰州 730101；2.敦煌医学与转化教育部重点实验室 兰州 730000；3.甘肃中医药大学基础医学院 兰州 730101）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive Pulmonary disease，COPD），是一种常见的慢性气道疾病，其特征是持续存在的气流受限及相应的呼吸系统症状[1]。COPD 发病机制复杂，目前尚未完全阐明，其中炎症反应是COPD 的重要发病机制，免疫失衡可导致慢性炎症持续加重，肺部及气道的炎症反应和机体免疫功能失衡是COPD 患者肺组织损伤甚至死亡的主要原因[2]。辅助性T 细胞1（helper T cells 1，Th1）和辅助性T 细胞2（helper T cells 2，Th2）失衡引起的促炎/抗炎因子失衡是COPD 重要发病机制之一，在免疫炎症反应机制中发挥了重要作用[3]。TNF-α 是COPD 发病过程中重要的炎症和免疫调节因子[4]。果蝇双翅边缘缺刻同源基因（Notch）通路的受体Notch1/2/3/4 与配体Delta1/3/4、Jagged1/2 均为表达于细胞表面的单跨膜蛋白，受体配体结合后引起信号活化，下游靶基因Hes 和Hey 家族被激活，从而影响T 淋巴细胞的分化、增殖、凋亡[5]。Notch 通路介导的炎症反应及免疫失衡与COPD 肺组织及气道炎症损伤关系密切[6]。因此，Notch 信号通路介导的Th1/Th2 细胞失衡是COPD 发生发展的重要病理机制。

目前现代医学治疗COPD 的常规方法包括支气管舒张剂、糖皮质激素等药物治疗及呼吸支持等非药物治疗[1]，常伴有不良反应及并发症，且经济负担较重，亟需探索更为安全有效的治疗方法。芪蛭皱肺颗粒由导师李金田教授基于多年临床经验及COPD 本虚标实的病机特点研治而成，诸药共奏益气活血祛痰、理肺除胀平喘之功。课题组前期基础研究证实，芪蛭皱肺颗粒具有缓解气道炎症、增强免疫功能、减轻氧化应激反应等作用[7-9]；临床研究表明，芪蛭皱肺颗粒联合西医常规治疗可有效改善AECOPD 患者痰瘀阻肺证症状[10]。

Th1、Th2、辅助性T 细胞17（Helper T cells 17，Th17）、调节性T 细胞（Regulatory T cells，Treg）均由CD4+T 细胞分化而来，Notch 信号通路可通过调控CD4+T 细胞的分化水平从而影响Th 细胞比例平衡[11]。部分研究表明通过调节Notch 信号通路从而调控Th17/Treg 平衡可能是防治COPD 的有效方法[12-13]，但少有研究从调节Notch 信号通路进而调控Th1/Th2 平衡的角度介入治疗COPD。基于此，本研究通过建立COPD 大鼠模型，进一步阐明Notch 信号通路与Th1/Th2 免疫平衡间的关系，以及研究芪蛭皱肺颗粒调控Th1/Th2 免疫平衡是否与Notch 信号通路相关，进一步明确芪蛭皱肺颗粒治疗COPD的作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF 级Wistar 大鼠70 只，雄性，体质量200±20 g，购自甘肃中医药大学动物实验中心，饲养于甘肃中医药大学SPF 级动物房，环境温度（24±1）℃，湿度55%±5%。动物质量证书许可证编号：SYXK（甘）2020-0001，动物设施使用证编号：SYXK（甘）2020-0009。

1.2 药物

芪蛭皱肺颗粒（生产批号：170501）：由黄芪、水蛭、党参、丹参、麦冬等组成，甘肃中医药大学附属医院中药制备室生产，1 g芪蛭皱肺颗粒相当于原生药材6 g。醋酸地塞米松片（浙江仙琚制药股份有限公司，药品准字号：H33020822）：0.75 mg/片。兰州香烟（甘肃烟草工业有限责任公司）：焦油量14 mg，烟气烟碱量1.1 mg，烟气一氧化碳量14 mg。

1.3 试剂

脂多糖（LPS）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio，货号分别为707F031、20210310、20211118）；Alexa Fluor®647 anti-rat IFN-γAntibody、PE anti-rat IL-4 Antibody（Biolegend，货号分别为 B311332、B332500）；Anti-Notch1 antibody（Abcam，货号ab167441）；Hes1 antibody（GeneTex，货号No.GTX108356）；Hey1 Rabbit Polyclonal antibody（Proteintech Group，Inc，货号19929-1-AP）；Anti-β-actin，Goat Anti-Rabbit、Goat Anti-Mouse（Immunoway Biotechnology，货号分别为YM3028、RS0002、RS0001）；Rat TNF-α ELISA KIT（武汉北鹿森生物科技有限公司，货号0153320221011）；柠檬酸（pH=6.0）抗原修复液、EDTA 抗原修复液（pH=9.0）、EDTA 抗原修复液（pH=8.0）、苏木素染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、组化试剂盒DAB 显色剂（Servicebio，货号分别为G1202、G1203、G1206、G1004、G1309、G1340、G1211）；TRIeasyTMTotal RNA Extraction Reagent TRIeasyTM总RNA 提取试剂（YEASEN，货号19926940）；Hyper ScriptⅢ RT Super Mix for qPCR with gDNA Remover、2×S6 Unlversal SYBR qPCR Mix（NovaBio，货号分别为F2439、F3528）。

1.4 仪器

WPB PLT-UNR-RT-2 动物肺功能检测系统（EMKA Beschlagteile）；RM2437 型轮转切片机（Leica Biosystems）；组化笔（Servicebio）；显微镜，成像系统（Nikon）；FACSCANTO Ⅱ流式细胞仪（Becton，Dickinson and Company）；iQTM5型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（Bio-Rad）；Mark1509 酶标仪（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 COPD大鼠模型制备

70 只Wistar 大鼠，随机选取10 只作为空白对照组，其余大鼠作为造模组，采用香烟烟雾（CS）联合气管滴注脂多糖（LPS）法建立COPD 模型[14]。分别于第1、14 天行气管插管，气管滴注0.2 mL LPS（1 g·L-1）；第2-13、15-28 天，每次将10 只左右大鼠放置在容积为150 L（60 cm×50 cm×50 cm）的自制有机玻璃染毒箱内进行被动吸烟，每天1次，每次30 min，每只1支。造模结束后，空白对照组及造模组各随机选取3 只大鼠进行肺功能与肺组织病理检测，以客观评价本次模型。

2.2 分组及给药

造模结束后，空白对照组常规喂养，造模组大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组及芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组。给药剂量参照《实验药理方法学》，大鼠给药剂量=人临床剂量/70 kg×6.3[15]。第29 天开始，按3.24、1.62、0.81 g·kg-1剂量分别给高、中、低剂量组大鼠灌胃芪蛭皱肺颗粒混悬液，阳性对照组给予醋酸地塞米松混悬液67.5 µg·kg-1，空白对照组和模型对照组给予等体积生理盐水（10 mL·kg-1），持续给药28天。

2.3 检测指标

2.3.1 观察大鼠一般状况

每日观察大鼠呼吸情况，鼻腔分泌物，精神活动状态，毛色，进食、饮水量等。每周称量并记录大鼠体质量。

2.3.2 肺功能

最后一次灌胃治疗结束后，从SPF 级动物房取出大鼠。做好标记，采用动物肺功能测试系统，清醒状态下检测吸气峰流速（PIF）和呼气峰流速（PEF）。

2.3.3 肺组织病理

各组大鼠肺功能检测完成后，禁食24 h，3%戊巴比妥钠（45 mg·kg-1）腹腔注射麻醉。腹主动脉取血，常温，3500 r·min-1，离心15 min，制备血清。解剖出完整的肺和气管，缓慢向气管内注入注射用生理盐水1 mL，再缓慢吸出，重复2 次，回收支气管肺泡灌洗液（BALF），无菌纱布过滤，置于离心管中，4℃，2000 r·min-1，离心5 min，取上清液。将血清、BALF 及部分肺组织置于-80冰箱中保存备用，其余肺组织采用4%多聚甲醛固定，包埋，切片，脱蜡至水，苏木素-伊红（HE）染色，脱水，透明后中性树胶封片，200 倍光镜观察肺组织病理变化。参考周勇等[16]的方法，根据支气管壁破坏程度、炎性细胞浸润程度、支气管腔内物质（“有无”及“多少”）、支气管周围肺泡病理改变等进行评分，无病变为0 分、轻度病变为1 分、中度病变为2 分、重度病变为3分。

2.3.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠血清及BALF中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量

取出-80℃冰箱保存的血清及BALF，按ELISA 试剂盒说明书操作。

2.3.5 流式细胞仪检测大鼠脾脏Th1/Th2细胞比例

取脾脏，研磨，200 目滤网滤过，制成单细胞悬液，缓慢加入大鼠淋巴细胞分离液，2500 r·min-1，离心20 min，调整淋巴细胞浓度为每毫升1×106个。加入CD4 抗体，4℃避光孵育30 min，用流式缓冲液洗涤，用破膜溶液对细胞固定破膜，分别加入藻红蛋白（PE）标记的IL-4 及Alexa Fluor 647 标记的IFN-γ 进行染色，4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测Th1、Th2 细胞表达水平，分析Th1/Th2亚群比例。

2.3.6 免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）检测肺组织Notch1蛋白表达

肺组织病理切片石蜡包埋，切片，脱蜡至水；枸橼酸盐缓冲液冲洗，高压锅煮沸，自然冷却，PBS 冲洗，H2O2封闭；加Notch1 抗体（1:200 稀释），室温孵育；加二抗后37℃孵育30 min，DAB 显色；自来水冲洗，苏木素复染数秒；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封固；光学显微镜（×400）下随机选取1个视野，以棕黄色为阳性染色，用Image-pro Plus 软件测定总的光密度值（IOD）。

2.3.7 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织Notch1、Hes1、Hey1蛋白表达

取出-80℃冰箱保存的肺组织，4℃冰箱解冻后加入RIPA 裂解液，经组织研磨仪研磨后，12000 r·min-1离心15 min，取上清液，用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。上样，80 V 电泳30 min，110 V 电泳1 h，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用全能型蛋白转印系统转膜，设置电流25 mA、15 min。5%脱脂奶粉室温下封闭4 h，加入鼠一抗Notch1（1∶1000 稀释），兔一抗Hes1（1∶1000 稀释）、Hey1（1∶2000 稀释）和内参β-actin（1∶5000 稀释），4℃孵育过夜。分别加入羊抗小鼠二抗（1:5000）及羊抗兔二抗（1∶5000），室温摇床孵育2 h，增强化学发光法显色，并用Image J 软件分析各组蛋白相对表达水平。

2.3.8 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肺组织Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表达

取出-80℃冰箱保存的肺组织，4℃冰箱解冻后，用总RNA 提取试剂提取肺组织总RNA 并测定其浓度和纯度，根据逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，按SYBR 试剂盒说明书和PCR 仪进行扩增，预变性95℃、30 s，PCR 扩增40个循环，95℃变性10 s，60℃退火30 s；以β-actin 为内参基因，根据2-ΔΔCt法计算Notch1、Hes1、Hey1 mRNA 的相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，序列如下：①Notch1 上游引物：5’-GCCAGCAAGAAGAAGCGGAGAG-3’，下游引物：5’-CCACTCGTTCTGATTGTCGTCCATC-3’（108 bP）；②Hes1 上游引物：5’-CTAACGCAGTGTCG CCTTCCAG-3’，下游引物：5’-AGAGAGGTGGGCTA GGGAGTTTATG-3’（116 bP）；③Hey1 上游引物：5’-C GGGAATGCCTGGCTGAAGTTG-3’，下游引物：5’-GGGATGCGTAGTTGTTGAGATGGG-3’（109 bP）；④β-actin 上游引物：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTC CTA-3’，下游引物：5’-GACTCATCGTACTCCTGCT TGCTG-3’（150 bP）。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠一般情况

造模过程中空白对照组大鼠无死亡，造模组大鼠因气管插管致2 只死亡，麻醉致2 只死亡，烟熏过程中4 只死亡，造模结束随机选取空白对照组与造模组各3 只用于验证模型是否成功；灌胃给药过程中无大鼠死亡。最终各组大鼠数量情况如下：空白对照组7只，模型对照组10 只，阳性对照组10 只，芪蛭皱肺高剂量组10 只，芪蛭皱肺中剂量组10 只，芪蛭皱肺低剂量组9只。

空白对照组大鼠呼吸状态平稳，精神情况良好，皮毛颜色正常有光泽，体质量匀速增长。28 天造模过程中，造模组大鼠逐渐出现喘促、鼻中分泌物由稀薄变粘稠等呼吸系统症状，伴有不同程度的毛色萎黄，此外出现活动力下降、体质量增长缓慢等。经28天灌胃治疗后，芪蛭皱肺高、中剂量组大鼠喘促等症状减轻，鼻腔分泌物逐渐减少，精神活动状态良好，皮毛逐渐恢复光泽；低剂量组大鼠一般状况改善不明显。

3.2 对COPD大鼠肺功能的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠PIF、PEF 显著降低（P<0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组及芪蛭皱肺高、中、低剂量组PIF、PEF 显著升高（P<0.05）；与阳性对照组比较，芪蛭皱肺中、低剂量组PIF、PEF显著降低（P<0.05）。见表1。

表1 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺功能的影（±s）

表1 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺功能的影（±s）

注：与空白对照组比较，$P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，*P<0.05。

组别空白对照组模型对照组阳性对照组芪蛭皱肺高剂量组芪蛭皱肺中剂量组芪蛭皱肺低剂量组n PEF（mL·s-1）43.57±8.85 6.71±0.47$36.59±5.35#34.81±4.34#25.04±3.24#*15.46±2.06#*7 10 10 10 10 9 PIF（mL·s-1）37.45±3.38 5.84±0.64$32.80±3.76#30.51±2.05#24.14±2.60#*15.86±1.89#*

3.3 对COPD大鼠肺组织病理变化的影响

空白对照组大鼠肺组织结构基本完整，少量炎性细胞浸润，支气管腔内可见少量嗜酸性物质，小面积肺组织出血，可能是灌胃生理盐水时因操作不当造成的损伤。模型对照组大鼠肺组织可见多灶性肺泡壁增厚，大量炎性细胞浸润，支气管可见上皮细胞坏死，核固缩，胞质空泡化，管腔内可见嗜酸性物质。阳性对照组可见中等面积肺泡壁增厚，少量炎性细胞浸润，支气管少量上皮细胞坏死，核固缩，胞质空泡化，管腔内可见少量坏死脱落的上皮细胞及嗜酸性物质。芪蛭皱肺高剂量组可见炎性细胞浸润，支气管少量上皮细胞坏死，核固缩，胞质空泡化，管腔内少量坏死脱落的上皮细胞，未见明显嗜酸性物质。中剂量组多灶性肺泡壁增厚，少量炎性细胞浸润，支气管上皮细胞坏死，核固缩，胞质空泡化。低剂量组可见肺泡扩张，肺泡壁大面积增厚，大量炎性细胞浸润，支气管可见上皮细胞水样变性，胞质疏松淡染，管腔内少量嗜酸性物质（见图1）。

图1 芪蛭皱肺颗粒对COPD模型大鼠肺组织病理学影响（HE，×200）

空白对照组肺组织病理半定量评分为（1.21±0.26）分，模型对照组为（2.65±0.52）分，阳性对照组为（1.44±0.37）分，芪蛭皱肺高剂量组为（1.51±0.41）分，中剂量组为（1.70±0.45）分，低剂量组为（1.93±0.48）分。与空白对照组相比，模型对照组半定量评分显著升高（P<0.05）；与模型对照组相比，阳性对照组及芪蛭皱肺颗粒高、中、低剂量组评分显著降低（P<0.05），差异具有统计学意义。

3.4 对COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影响

与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量均显著升高（P<0.05）。与模型对照组相比，阳性对照组及芪蛭皱肺高、中、低剂量组血清及BALF 中TNF-α 含量均显著降低（P<0.05）。与阳性对照组比较，芪蛭皱肺中、低剂量组血清及BALF 中TNF-α含量均显著升高（P<0.05）（见表2）。

表2 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影响（±s）

表2 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影响（±s）

注：与空白对照组比较，$P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，*P<0.05。

n BALF（pg·mL-1）73.44±5.23 179.90±8.47$98.27±6.20#109.75±6.07#125.45±6.85#*153.33±7.50#*组别空白对照组模型对照组阳性对照组芪蛭皱肺高剂量组芪蛭皱肺中剂量组芪蛭皱肺低剂量组7 10 10 10 10 9血清（pg·mL-1）55.38±5.08 153.51±6.83$83.61±5.69#96.56±5.22#118.85±5.78#*132.81±5.21#*

3.5 对COPD大鼠脾脏Th1/Th2细胞比例的影响

与空白对照组相比，模型对照组大鼠脾脏Th2 细胞水平明显升高，Th1 水平明显下降，Th1/Th2 细胞比例呈不均衡状态（均为P<0.05）。与模型对照组相比，阳性对照组及芪蛭皱肺高、中剂量组Th2 细胞水平明显降低（均为P<0.05）；阳性对照组及芪蛭皱肺高、中、低剂量组Th1水平均明显升高，Th1/Th2比例逐渐恢复平衡（均为P<0.05）。与阳性对照组比较，芪蛭皱肺高、中、低剂量组Th2 水平明显升高，Th1 水平明显降低（P<0.05）（见表3，图2、图3）。

图2 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠脾脏中Th2细胞比例的影响

图3 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠脾脏中Th1细胞比例的影响

表3 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠脾脏Th1/Th2细胞比例的影响（±s）

表3 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠脾脏Th1/Th2细胞比例的影响（±s）

注：与空白对照组比较，$P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，*P<0.05。

Th1/Th2 3.25±0.11 0.23±0.01$2.29±0.10#1.48±0.01#*0.58±0.01#*0.41±0.02#*组别空白对照组模型对照组阳性对照组芪蛭皱肺高剂量组芪蛭皱肺中剂量组芪蛭皱肺低剂量组n 7 10 10 10 10 9 Th1（%）4.63±0.17 1.31±0.10$3.47±0.09#2.88±0.11#*2.31±0.12#*2.15±0.14#*Th2（%）1.42±0.05 5.70±0.71$1.52±0.10#1.95±0.09#*3.97±0.24#*5.19±0.11*

3.6 芪蛭皱肺颗粒对COPD 大鼠肺组织Notch1 蛋白表达的影响

与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织Notch1 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型对照组相比，阳性对照组及芪蛭皱肺颗高、中剂量组Notch1 蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与阳性对照组相比，芪蛭皱肺低剂量组Notch1 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）（见表4，图4）。

图4 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织Notch1蛋白表达的影响（免疫组化，×400）

表4 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织Notch1蛋白表达的影响（±s）

表4 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织Notch1蛋白表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，$P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，*P<0.05。

Notch1 0.02±0.01 0.22±0.04$0.11±0.02#0.10±0.01#0.14±0.01#0.18±0.02*组别空白对照组模型对照组阳性对照组芪蛭皱肺高剂量组芪蛭皱肺中剂量组芪蛭皱肺低剂量组n 7 10 10 10 10 9

3.7 芪蛭皱肺颗粒对COPD 大鼠肺组织Hes1、Hey1蛋白表达的影响

与空白对照组相比，模型对照组大鼠肺组织Hes1、Hey1 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型对照组相比，阳性对照组及芪蛭皱肺高、中、低剂量组Hes1、Hey1 蛋白表达水平显著降低（P<0.05）；与阳性对照组相比，芪蛭皱肺低剂量组Hes1蛋白表达水平显著降低，中、低剂量组Hey1 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）（见表5，图5）。

图5 各组大鼠肺组织Hes1、Hey1蛋白表达电泳

表5 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织Hes1、Hey1蛋白相对表达量的影响（±s）

表5 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织Hes1、Hey1蛋白相对表达量的影响（±s）

注：与空白对照组比较，$P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，*P<0.05。

Hey1/β-actin 0.38±0.03 0.81±0.04$0.56±0.03#0.56±0.02#0.68±0.02#*0.70±0.02#*组别空白对照组模型对照组阳性对照组芪蛭皱肺高剂量组芪蛭皱肺中剂量组芪蛭皱肺低剂量组n 7 10 10 10 10 9 Hes1/β-actin 0.38±0.02 0.72±0.04$0.39±0.02#0.39±0.01#0.45±0.02#0.49±0.03#*

3.8 对COPD 大鼠肺组织Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠肺组织Notch1、Hes1、Hey1 mRNA 表达明显升高（P<0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组及芪蛭皱肺高、中、低剂量组Notch1、Hey1 mRNA 表达明显降低，阳性对照组及芪蛭皱肺高、中剂量组Hes1 mRNA 表达明显降低（均为P<0.05）；与阳性对照组比较，芪蛭皱肺中、低剂量组Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）（见表6）。

表6 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表达的影响（±s）

表6 芪蛭皱肺颗粒对COPD大鼠肺组织Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，$P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与阳性对照组比较，*P<0.05。

组别空白对照组模型对照组阳性对照组芪蛭皱肺高剂量组芪蛭皱肺中剂量组芪蛭皱肺低剂量组n Hey1 1.00±0.08 2.16±0.09$1.21±0.07#1.25±0.03#1.66±0.05#*1.88±0.06#*7 10 10 10 10 9 Notch1 1.00±0.06 2.51±0.10$1.46±0.05#1.52±0.03#1.85±0.13#*2.23±0.04#*Hes1 1.01±0.13 1.92±0.06$1.29±0.05#1.29±0.02#1.59±0.07#*1.83±0.05*

4 讨论

中医认为COPD 属“肺胀”“咳嗽”“喘证”等范畴，以咳嗽咳痰、胸闷胀满、气促喘急等为主要症状，严重者有燥烦感，甚至出现惊厥、喘脱等危候[17]。《丹溪心法·咳嗽》曰：“肺胀而咳……此痰挟瘀血碍气而病。”[18]COPD 病机特点可概括为本虚标实，肺脾肾三脏虚损，痰瘀交阻。COPD 稳定期以虚为主兼见痰瘀，治疗以补正扶虚为主。急性加重阶段（Acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）以痰瘀为主兼见正虚，治疗以宣肺祛邪为主，降气化痰，活血化瘀[19]。COPD 的治疗目前临床尚无特效药，现代医学疗法常伴有并发症及不良反应，且经济负担较重，亟需探索更为安全有效的治疗方法。芪蛭皱肺颗粒根据COPD 本虚标实的病机特点研制而成，组方中黄芪补气固本益肺，水蛭破血逐瘀通经；党参益肺健脾，丹参、赤芍活血祛瘀；白芥子温中散寒止咳，枳实破气化痰，桔梗化痰止咳平喘；五味子纳气定喘、敛肺止咳，麦冬润肺养阴。诸药共奏益气活血逐痰、理肺除胀平喘之功。现代药理学研究表明，黄芪有效成分黄芪多糖、黄芪甲苷，可诱导产生干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ），发挥免疫调节作用[20]，黄芪多糖可有效减轻COPD 大鼠炎症反应[21]；水蛭具有抗炎、抗凝血、抗血栓作用[22]，重组水蛭素可减轻COPD 大鼠气道重塑[23]；党参具有免疫调节及抗肿瘤作用[24]，可缓解COPD 小鼠气道炎症[25]；丹参具有抗血栓、抗肿瘤等作用[26]，丹参酮ⅡA 可减轻COPD 大鼠炎症反应等[27]。课题组前期研究表明，芪蛭皱肺颗粒能够抑制COPD 大鼠白细胞介素4（Interleukin-4，IL-4）功能亢进，同时促进IFN-γ 的表达，恢复Th1/Th2 免疫平衡，从而减轻肺组织及气道炎症[8]。

现代医学尚未完全阐明COPD 发病机制，炎症反应及免疫紊乱是导致发病的重要原因之一，T 淋巴细胞介导的过度免疫反应在COPD 发生发展过程中发挥着重要作用[28]。COPD 存在气道及肺实质的慢性炎症，慢性炎症状态使得T淋巴细胞特异性转化和激活，造成免疫紊乱，激活的Th1、Th2、Th17、Treg 等细胞进一步释放炎性介质，对气道及肺实质进行破坏[29]。T淋巴细胞可分化为Th1和Th2细胞，两者在功能上相互拮抗，机体正常时处于动态平衡状态。COPD 发病阶段Th1细胞在COPD稳定期优势表达，而Th2细胞在AECOPD 阶段优势表达，Th1/Th2 免疫失衡使得炎症反应加剧[30]。恢复Th1/Th2 免疫平衡对COPD 的治疗尤为关键。Notch 信号通路介导细胞靠近接触之后的活化效应，4 个受体Notch1/2/3/4 和5 个配体Delta1/3/4、Jagged1/2均为表达于T淋巴细胞等成熟免疫细胞表面的单跨膜蛋白；当受体与配体结合后，具有转录活性的胞内段NICD 被释放，与转录因子CSL 结合，从而激活下游靶基因Hes 和Hey 家族，最终影响T 淋巴细胞的分化与凋亡等[5,31]。有研究表明，2 型先天性淋巴样细胞（ILC2s）可以通过激活Notch/GATA3 信号通路促进AECOPD 阶段Th2 细胞的分化[32]。Notch 信号通路在肺部疾病发生发展过程中起着重要作用。研究表明，Notch 信号通路激活介导的klotho 甲基化通过加重炎症反应及细胞凋亡促进COPD 发展[33]。在未成熟的内皮细胞中，Notch1 是COPD 肺微血管再生的潜在标志物[34]。COPD 发病前可在气肿性肺组织中观察到肺微血管内皮细胞的异常凋亡，MiR-34a 通过调节Notch1 减轻CS 诱导的肺内皮细胞凋亡[35]。而Notch1在COPD 中还可通过细胞外调节蛋白激酶（ERK）途径调节CS 诱导的内皮细胞凋亡[36]。长基因间非编码RNA00612（LINC00612）可通过调节血清微小核糖核酸-31-5p（miR-31-5p）/Notch1 信号通路减轻人肺微血管内皮细胞株（hpmec）凋亡，炎症和氧化应激反应[37]。异硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate，AITC）可通过Notch1 信号通路上调多药耐药蛋白（MRP1）含量，从而减轻症状[38-39]。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是常用COPD 治疗剂，Notch 信号通路通过磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）途径缓解CS 诱导的BM-MSCs 功能障碍[40]。Notch 信号通路介导的Th1/Th2免疫失衡是COPD发生发展的重要病理机制。

肺功能及组织病理学是COPD 模型成功的金标准[41]。本研究根据采用香烟烟雾联合气管滴注LPS 法建立COPD模型，造模后给药前空白对照组及造模组各随机选取3只大鼠进行肺功能及组织病理学检测，肺功能及组织病理学结果均提示本次造模成功。经给药干预后，肺功能结果显示，与正常对照组比较，造模组大鼠PIF、PEF值均明显降低；肺组织病理切片显示，造模组大鼠肺组织与气道出现支气管及其周围肺泡的病变。经给药干预后，空白对照组大鼠及COPD模型大鼠肺功能及病理切片结果与造模后给药前的结果相一致。

TNF-α 可放大COPD 炎症过程，参与气道炎症状态的形成，其表达伴随气道炎症状态加重而增加[42]。与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量显著升高，提示COPD 大鼠肺组织及气道有慢性炎症反应。COPD 发病过程中存在免疫细胞分化及功能的紊乱[43]，Notch信号通路在调节呼吸系统疾病Th1/Th2 免疫失衡中发挥重要作用[44]，Notch 信号通路过度激活介导的Th1 和Th2 细胞失衡是COPD 重要发病机制。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型对照组存在Th1/Th2 免疫失衡，平衡向Th2 方向移动，提示COPD 发病过程中存在免疫紊乱。与空白对照组比较，模型对照组大鼠肺组织Notch1、Hes1、Hey1蛋白及mRNA 表达显著升高，提示Notch 信号通路在COPD大鼠体内被激活，参与发病过程。

芪蛭皱肺颗粒可能通过抑制Notch 信号通路过度表达，进而促使Th1/Th2 免疫平衡恢复，对COPD 发挥抗炎及保护肺功能的作用。研究结果表明，与模型对照组大鼠比较，芪蛭皱肺高、中、低剂量组大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量显著降低，流式细胞术结果显示Th1/Th2 免疫平衡得到一定恢复，平衡向Th1 方向移动，提示芪蛭皱肺颗粒通过调节Th1/Th2 免疫平衡从而减轻炎症反应；IHC、Western blot 及PCR 结果显示，与模型对照组大鼠比较，芪蛭皱肺高、中、低剂量组大鼠Notch1、Hes1、Hey1 蛋白及mRNA 表达显著降低，提示芪蛭皱肺颗粒通过抑制Notch 信号通路激活发挥对COPD 的治疗作用。芪蛭皱肺高、中、低剂量组支气管及其周围肺泡病变均有所改善，组织结构逐渐趋于正常，各给药组PIF、PEF 显著升高，佐证了芪蛭皱肺颗粒对肺组织结构及肺功能的保护作用。

综上所述，芪蛭皱肺颗粒可调节COPD 大鼠免疫功能，减轻肺组织及气道炎症，其作用机制可能是通过抑制Notch 信号通路的过度表达，进而促使Th1/Th2恢复平衡。本研究从免疫炎症角度为芪蛭皱肺颗粒治疗COPD 提供了理论依据，但未对组成成分深入分析，今后需进一步探索其药效物质基础，完善药效、毒理实验；此外，中医药治疗COPD 靶点较多，需继续探究芪蛭皱肺颗粒防治COPD 的干预靶点，为临床应用提供参考。