水生动物疾病快速检测技术应用情况研究

◎ 文/张翔 余卫忠 蔡晨旭 周密 裴育 冯东岳*

水生动物疾病快速检测技术能够实现现场筛查，减少带病流通和带病养殖等问题，是弥补实验室检测周期长、步骤复杂等短板的有效措施，对提升水生动物疾病防控能力、确保养殖生产安全具有重要意义。本研究通过数据调度和实地调研相结合的方式，重点就快速检测常用技术、产品基本情况、产品管理和应用情况、当前主要问题等进行分析，有针对性地提出推动优化审批流程、开展产品比对评价、健全完善标准技术、提升科技支撑能力等监管建议。

水生动物疾病问题是实现水产养殖业高质量发展的瓶颈因素之一。目前，水生动物疾病的诊断、监测和检疫主要以实验室检测为主，存在检测周期长、步骤复杂、难以满足市场需求等问题。应用快速检测技术能够实现现场迅速筛查，减少带病流通和带病养殖等问题，对提升水生动物疾病防控能力、确保养殖生产安全具有重要意义。

全国水产技术推广总站、中国水产学会组织成立调研组先后赴江苏省、浙江省、广东省等地进行专题调研，开展解剖麻雀式调研，坚持问题导向，既要“把准脉”，更要“开对方”，找到解决问题的办法。总体看，作为实验室检测的有力补充，近年来各水产科研院所、高校、企业等积极开展了水生动物疾病快速检测技术研发工作，取得了一定进展，部分产品可实现现场检测，弥补了实验室检测在时效性方面的短板，做到早发现，早控制。但也存在新产品申请注册难、标准体系不健全、自主创新能力弱等问题，亟需进一步研究推动解决。

一、水生动物疾病快速检测常用技术

目前，水生动物疾病快速检测产品的研发主要基于分子生物学技术。

（一）分子生物学检测技术

分子生物学检测技术通过捕捉鉴定目标病原体的核酸分子以证实病原，近年来在水产病原快速检测领域发展迅速。需要注意的是，当分子生物学检测结果为阳性时，仅表示检测样品中存在病原体的核酸，并不能证明样品中存在具有感染性的病原体，应综合考虑临床症状、流行病学等证据进行判断。

1.聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）

通过体外扩增水生动物样品中的特异性靶基因序列检测病原，其中实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）是通过设计特异性的荧光标记核酸探针或加入染料，进行PCR扩增来检测荧光强度，达到鉴定PCR产物（病原体核酸）的技术。该技术以其敏感、特异、稳定、可定量的优点在我国水生动物疾病检测实践中广泛应用。但qPCR需要由专业人员使用热循环设备在实验室环境内操作，这限制了该方法在现场筛查和低资源地区的使用。

2.环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）

该技术可在60℃～65℃、20min～60min实现109倍～1010倍的恒温核酸扩增。LAMP技术特异性较强，不依赖变温设备，扩增结果观察便捷，适用于即时检测，且专利保护已经过期。但其引物设计难度较高，难以扩增500bp以上的长链靶序列。

3.重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）和重组酶介导等温扩增技术（Recombinase Aided Amplification，RAA）

RPA和RAA能够实现在37℃～42℃的恒温范围内快速扩增目标核酸。RAA是对RPA的改良，反应的温度适应性更强。两种方法对设备要求低，反应试剂已能够以冻干形式提供。不足之处在于不适合较短靶序列的检测，并且没有专门的引物设计软件。

4.微流控芯片技术

使用微管道（微米级）处理或操纵微小流体，把分离、检测等操作单元集成到一块微米尺寸的芯片上，借由微管道形成的网络，使流体以可控的形式贯穿系统并完成分析全过程的技术。具有体积轻巧、样品试剂用量少等优点，可为LAMP等方法提供微量密闭反应空间，有助于实现高通量和避免气溶胶污染，提高检测结果的准确性。

（二）免疫学检测技术

免疫学检测是利用特异性抗原抗体反应检测病原的诊断技术。由于软体动物和甲壳动物在病原感染后无抗体产生，难以进行免疫学检测；鱼类和两栖类存在研究基础较为薄弱、纯病毒获取难度高导致抗体制备难度较大等问题，免疫学方法进展相对较慢。

1.酶免疫技术

在兽用快速诊断中应用较为广泛的主要是酶联免疫吸附技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），是利用酶标记抗原或抗体以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。相比于其他一些免疫学检测方法，ELISA敏感性高、特异性强、检测时间较短，结果容易判读，可实现半定量甚至定量检测。

2.胶体金技术

胶体金免疫技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的免疫标记技术。目前运用最多的胶体金免疫层析技术（Colloidal Gold Immunochromatography Assay，GICA），以其快速简便、可对单样本检测、可肉眼判读、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，已成为常用的免疫检测技术之一。

二、水生动物疾病快检产品基本情况

本次调研共收到368条快速检测产品的问卷信息，去重后得到来自14家企业的261条产品信息，其中试剂盒类258种，小型仪器设备3种，但没有产品通过兽药审批。

（一）检测试剂盒情况

从疾病类别看，以鱼类和虾类快检产品为主。共收到鱼类疾病快检试剂盒信息132条，占比51.16%；虾类试剂盒信息106条，占比41.09%；蟹类、贝类、鳖等其他类共20条，合计占比7.75%。检测病原涵盖了鱼、虾、蟹、贝等类别的主要养殖品种。此外，除鲍疱疹病毒病、牡蛎疱疹病毒病和两栖类蛙虹彩病毒病外，已覆盖了《一、二、三类动物疫病病种名录》中全部水生动物病毒病及部分细菌病、寄生虫病。

从技术原理看，主要采用荧光定量P C R（q P C R）和等温扩增技术（LAMP）。共收到基于分子生物学原理的产品256条，其中PCR法151条（qPCR法135条）、占比58.5%，等温扩增法105条、占比40.7%（其中，LAMP法79条，RAA及RPA法共26条，分别占比30.6%和10.1%）；基于免疫学原理的产品2条，占比0.8%，均处于研发阶段。14家生产企业中，有10家基于qPCR/PCR法进行研发，可能与现行水生动物疾病诊断标准中多采用qPCR/PCR法有关。

从检测成本看，单样本单指标检测费用普遍在30元～50元。检测时间根据技术原理不同有所差别，基于等温扩增法（LAMP、RAA）的产品，检测时间在0.5h～1h；基于qPCR法的产品PCR反应时间在1h～1.5h。需要注意的是，基于qPCR原理的快检产品一般需要进行前处理，即样品的核酸提取。有的快检产品没有包含核酸提取所需的试剂及耗材，需要单独购买用于核酸提取的试剂盒，这部分的费用和时间（约30min）可能没有计入厂家反馈的检测价格和检测时间。

（二）检测设备情况

水生动物病原快速检测设备大多基于qPCR法，以打造便携的“实验室”为主要目的，如广州双螺旋基因技术有限公司和浙江正合谷生物科技有限公司生产的手提式移动“实验室”等。这类检测设备一般包含三个部分：一套固定的检测箱，包括用于振荡、离心、加热的仪器；一套试剂盒，用于检测（不同）病原的试剂盒；一套相关软件，用于处理试验流程及结果。

三、水生动物疾病快检产品管理、研发、生产和应用情况

（一）管理方面

《兽药管理条例》明确用于诊断动物疾病的诊断制品属于兽药，《兽用生物制品经营管理办法》明确兽医诊断制品纳入兽用生物制品管理。在新产品研发方面，实施注册管理；在企业准入方面，实施兽药生产许可证和兽药生产质量管理规范（GMP）管理。对申请批准文号的，依据《中华人民共和国兽药典》和国家标准进行审查和核发，对申请批签发的按批签发程序进行审核。据了解，目前没有任何一种水生动物疾病快检产品通过兽药审批。

（二）研发方面

通过中国专利检索平台检索及初步统计，水生动物疾病诊断或检测相关的授权发明专利共248项，包含鱼类121项、虾类87项、蟹类12项、贝类21项、其他类7项，获得授权的申请单位以水产科研教学单位为主，通过成果转化等方式与企业开展合作，进行推广应用。近年来，农业农村部、科学技术部、国家自然科学基金委员会等部门机构的一些科研项目中，包含水生动物疾病快速检测技术开发与应用等内容。

（三）生产方面

本次调研的生产企业有14家，规模大小不一，注册资金差异较大，最低为100万元，最高为8000万元。生产企业主要分布在沿海省份，整体呈现由南至北递减的趋势。其中，具备GMP认证生产车间的共5家，占比36%。

（四）应用方面

应用方面主要集中在三个环节，为养殖水生动物或水产品检测提供初筛结果。一是养殖生产环节。从种源到养成水产品流入餐桌，包括育种公司、育苗公司、苗种标粗场，养殖户和流通商等。二是生产服务环节，包括水产养殖调水用品销售门店、水产饲料销售门店、社会第三方检测机构和保险公司等。三是流通监管环节，包括水产技术推广系统、水生动物疾病预防控制系统和海关部门等。

四、存在问题

（一）“证”的问题，获得注册审批难

水生动物疾病诊断产品需申请兽药注册证书。按照《兽医诊断制品注册分类及注册资料要求》，临床试验“由不少于3家兽医实验室对3批诊断制品进行适应性检测，并出具评价报告”，其中，“兽医实验室”应为农业农村部考核合格的省级以上兽医主管部门设置的兽医实验室。但目前我国“兽医实验室”主要承担陆生动物疫病检测相关技术支撑工作，尚不覆盖水生动物疾病内容。目前水生领域没有实验室通过兽医实验室考核。如在农业农村部设立的水生动物疫病重点实验室或《国家水生动物疫病监测计划》参考实验室等水生领域实验室开展临床试验，则可能存在由于不能满足法规要求，导致注册申报无效的风险。水生动物疾病快检产品临床验证难。

（二）“用”的问题，管理机制不健全

药残检测等食品安全领域的快检技术已由《食品安全法》和《农产品质量安全法》明确了法律地位和适用范围，而水生动物疾病快检仅在《鱼类产地检疫规程》《甲壳类产地检疫规程》《贝类产地检疫规程》中，明确了在水产苗种产地检疫工作中可应用“农业农村部批准的快速检测试剂盒进行检测”。在快检技术可应用的其他领域，例如育苗、疾病监测、水产品初加工原料检测等环节没有明确规定，快检的具体适用范围、效力等尚处于空白状态，采用快检得到的阳性结果不能直接作为定性及检疫依据，仍需送实验室检测以获得检测报告。因此，亟须进一步明确快检技术在水生动物疾病全链条防控中的作用和地位。

（三）“标”的问题，标准体系不完善

快速检测技术涉及的学科领域较多，唯一的国家标准《快速检测 术语与定义》属于术语类标准。在行业标准方面，目前农业农村部发布的含有水生动物疾病快速检测方法的7项行业标准均采用LAMP法，疾病种类包括鲤春病毒血症、草鱼出血病、传染性造血器官坏死病、鲤浮肿病、桃拉综合征、白斑综合征、对虾病毒性偷死病，尚不能覆盖疫病名录中鱼类和甲壳类的病毒病等，快检标准数量不足，方法单一，难以满足行业实际需求。此外，标准物质的缺失制约了诊断制品发展。各生产单位目前所用的“质量标尺”各不相同，直接影响了产品性能评价，可能出现不同厂家的产品，对同一样品的检测出现结果差异。

（四）“质”的问题，自主创新能力弱

多数快检产品生产企业规模较小、资金实力偏弱、研发投入比例小，缺乏自主知识产权，技术水平良莠不齐，存在低水平重复研究、产品同质化等问题。部分企业自身不具备GMP资质，不同批次产品的质量存在波动。整体来看，现有的水生动物疾病快检产品检测假阳性率偏高，灵敏度、精确性、可重复性等性能普遍不够稳定，部分关键酶主要依靠进口；产品对检测人员的技术水平仍有一定要求，无法实现“样品进，结果出”，检测成本仍然偏高，技术水平及自主创新能力需要进一步提升。

五、对策建议

（一）推动优化审批流程

一是加强与兽药审批部门对接。考虑到体外诊断制品强调特异性、敏感性，不直接作用于水产养殖动物，对动物群体及个体不存在安全风险，与对疫苗及血清的安全、有效、稳定的要求有所不同。建议结合实际简化申报技术要求，实施与预防、治疗用生物制品的差别化管理，缩短准入周期。二是推动出台水生动物防疫实验室规范管理制度，启动国家水生动物疾病参考实验室、专业实验室申报与评估，为快检产品开展临床试验、标准物质和标准样品制备等工作提供技术支撑。

（二）开展产品比对评价

2022年新修订的《鱼类产地检疫规程》《甲壳类产地检疫规程》《贝类产地检疫规程》为快检产品应用留出了空间。针对目前没有快检产品获得新兽药批准文号的现状，建议可参照陆生动物疫病快检产品评价方法，对水生动物疾病诊断产品实施评价和指定使用范围。在现行注册基础上，委托国家水生动物疾病参考实验室提供标准物质，并开展水生动物快速诊断产品的比对评价，经评价合格后用于水产苗种产地检疫、国家或地方水生动物疾病监测等工作，为相关工作提供参考和技术支撑。

（三）健全完善标准技术

目前，单一的水生动物疾病快速检测诊断方法已不能作为国家标准或行业标准单独立项。建议相关单位在制修订水生动物疾病诊断方法类标准时，可将成熟适用的快速检测方法纳入其中，为出具检测报告等提供相关依据，并鼓励相关企业积极参与到标准制修订工作中。同时，考虑到在流行病学方面病原菌株/毒株的变化，针对核酸扩增类快检产品，应根据病原的主要流行株及时更新引物、探针等，以提高检测的特异性和敏感性，更好地满足市场需求。

（四）提升科技支撑能力

一是突出政府规范管理的导向性。针对产品同质化严重，产品以仿制为主的问题，从审批端入手，在新兽药证书、批准文号审批上严格把关，提升产品质量控制水平。通过研究开发费用税前加计扣除等政策，引导企业加大研发投入。二是强化企业科技创新主体地位。国外兽用生物制品企业多具有较强的研发创新能力，研发投入一般占年销售额10%～15%。引导有条件的企业加大科研投入，建立研发中心，联合水产科研教学单位开展产学研合作，开发水生动物疾病快速诊断和高通量检测产品，不断夯实酶、抗体等诊断关键试剂的研制基础，搭建推广应用平台，向专业化和规模化发展。