circFOXK2靶向miR-4677-3p促进口腔鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移

龚 瑶,李梦园,章 茜

(南京大学医学院附属口腔医院 口腔颌面外科门诊,江苏 南京 210008)

口腔鳞癌(OSCC)是最常见的头颈部肿瘤亚型,全球每年有超过35万新确诊病例和18万死亡病例[1]。尽管在手术技术和放化疗方面取得了较大进展,但OSCC病人总生存率并未得到明显改善。OSCC具有局部侵袭性强和颈部淋巴结转移特点,深入研究其进展和转移分子机制是开发新型有效OSCC治疗方法的关键。环状RNA(circRNA)是由共价键形成的闭合型RNA分子,其包含miRNA特异性结合位点,可通过抑制miRNA的调控作用来调节mRNA表达,广泛参与细胞代谢、增殖、转移和凋亡等诸多生物学过程[2]。circFOXK2在胰管腺癌细胞和大多数原发肿瘤中显著上调,促进细胞生长和侵袭,参与细胞周期进展[3]。然而目前鲜见circFOXK2和OSCC的相关报道。miR-4677-3p是肺癌的抑制因子,上调其表达能够抑制肺癌细胞增殖和迁移[4]。此外,miR-4677-3p还介导敲减circ_0001421对肺癌细胞的恶性行为和糖酵解的抑制作用[5]。靶基因预测显示miR-4677-3p是circFOXK2的潜在靶点,但circFOXK2靶向miR-4677-3p在OSCC进展中的调控作用并不清楚。为此,本研究重点探讨circFOXK2和miR-4677-3p对OSCC恶性行为的影响和调控机制,旨在为OSCC的防治提供重要的实验数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 OSCC组织 OSCC组织和匹配癌旁组织来源于2017年3月至2020年12月在我院行手术治疗的45例OSCC病人,其中男32例,女13例,年龄48～75岁。所有OSCC病人在手术前均未接受过辅助放疗或化疗。所有样本均由我院2位病理专家证实,然后立即在-80 ℃保存。病人均签署知情同意书,且该研究获得了我院伦理委员会的批准。

1.1.2 细胞和试剂 OSCC细胞HSC-3购自美国ATCC;Transwell板购自美国Corning公司;细胞计数试剂盒(CCK-8)购自北京博奥森公司;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)兔多抗(ab9485)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)兔多抗(ab97779)、MMP-9兔多抗(ab38898)购自上海艾博抗公司;重组报告质粒、si-NC、si-circFOXK2、模拟物阴性对照miR-NC、miR-4677-3p模拟物、pcDNA-circFOXK2、抑制物阴性对照anti-miR-NC、miR-4677-3p抑制物(anti-miR-4677-3p)、pcDNA购自苏州鸿迅生物;逆转录试剂盒购自大连宝生生物公司;Power SYBRTM Green PCR Master Mix购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测circFOXK2和miR-4677-3p表达 采用Trizol试剂从OSCC组织中分离总RNA,RNA质量和浓度通过紫外分光光度法确定。用逆转录试剂盒合成cDNA,用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ进行RT-qPCR。用2-ΔΔCt法方法计算circFOXK2(GAPDH为内参)和miR-4677-3p(U6为内参)相对表达量。

1.2.2 细胞培养和分组 HSC-3细胞在补充有10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM/F12培养基中培养,培养箱环境为37 ℃、含5%CO2。在6孔板中接种5×105个对数期HSC-3细胞,将Lipo2000与si-NC、si-circFOXK2、miR-NC、miR-4677-3p模拟物、pcDNA、pcDNA-circFOXK2、si-circFOXK2+anti-miR-NC、si-circFOXK2+anti-miR-4677-3p加入到60%融合度的HSC-3细胞中,培养48 h收获细胞,RT-qPCR检测circFOXK2或miR-4677-3p表达后用于进一步实验。根据转染序列或载体不同共分为si-NC组、si-circFOXK2组、miR-NC组、miR-4677-3p组、pcDNA组、pcDNA-circFOXK2组、si-circFOXK2+anti-miR-NC组、si-circFOXK2+ anti-miR-4677-3p组。

1.2.3 集落形成实验检测细胞克隆数 转染48 h后,用胰酶消化细胞,将1×105个转染细胞接种到6孔板,培养2周后,去除培养基,用4%多聚甲醛固定细胞集落10 min,随后将细胞用0.5%结晶紫染色。显微镜下计数>50个细胞的克隆数。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力 在96孔板中接种1×105个细胞,孵育2 d后每孔加入10 μL的CCK-8试剂,继续孵育2 h,用酶标仪在450 nm处测定吸光度(OD)值。

1.2.5 划痕愈合实验检测细胞迁移能力 用记号笔在6孔板背面划一条直线。在6孔板中接种5×105个转染细胞,37 ℃培养箱孵育至细胞基本融合,用200 μL移液管尖端沿6孔板背面直线划伤单层细胞,PBS洗涤去除细胞碎片。继续孵育24 h,显微镜下拍照,Image J软件测定划痕宽度,并计算划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力 用无血清培养基重悬转染48 h的HSC-3细胞,取200 μL接种在预包被基质胶的上室中。在下室中加入完全培养液作为引诱剂。37 ℃培养24 h,用棉签轻轻去除留在上表面的HSC-3细胞,将穿膜细胞固定,并进行结晶紫染色。在光学显微镜下随机选择5个视野拍照,以细胞数的均值表示侵袭数。

1.2.7 Western blotting检测MMP-2和MMP-9蛋白水平 用预冷RIPA缓冲液提取总蛋白质,然后在SDS-PAGE上分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在5%脱脂牛奶中封闭1 h,将膜与适当浓度的一抗(包括MMP-2、MMP-9和内参GAPDH抗体)在4 ℃孵育过夜。用酶标二抗在室温下与膜结合2 h。用化学发光检测试剂盒检测蛋白条带,并使用Quantity One软件分析目的蛋白相对灰度值。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 分别将包含miR-4677-3p结合位点的circFOXK2野生(WT)序列或突变(MUT)序列分别克隆到psiCHECK-2报告载体,产生WT-circFOXK2、MUT-circFOXK2。在HSC-3细胞中共转染报告质粒与miR-NC或miR-4677-3p模拟物,转染48 h后检测细胞裂解物中相对荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

采用t检验、方差分析和q检验。

2 结果

2.1 circFOXK2和miR-4677-3p在OSCC组织中的表达

OSCC组织circFOXK2表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),miR-4677-3p表达水平显著低于癌旁组织(P<0.01)(见表1)。

表1 OSCC组织中circFOXK2和miR-4677-3p表达

2.2 抑制circFOXK2表达对HSC3细胞增殖、侵袭和迁移的影响

与转染si-NC相比,转染si-circFOXK2导致HSC3细胞circFOXK2表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与si-NC组相比,si-circFOXK2组HSC3细胞MMP-2和MMP-9蛋白水平、细胞OD值、克隆形成数、划痕愈合率、侵袭数均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)(见表2、图1)。

表2 抑制circFOXK2表达对HSC3细胞增殖、侵袭和迁移的影响

2.3 miR-4677-3p过表达对HSC3细胞增殖、侵袭和迁移的影响

与转染miR-NC比较,转染miR-4677-3p模拟物导致HSC3细胞miR-4677-3p表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。miR-4677-3p组HSC3细胞MMP-2和MMP-9蛋白水平、细胞OD值、克隆形成数、划痕愈合率、侵袭数显著低于miR-NC组(P<0.01)(见图2、表3)。

表3 miR-4677-3p过表达对HSC3细胞增殖、侵袭和迁移的影响

2.4 circFOXK2靶向调控miR-4677-3p的表达

StarBase预测到circFOXK2的序列中含有miR-4677-3p的结合位点(见图3)。与WT-circFOXK2共转染时,转染miR-4677-3p模拟物与转染miR-NC相比导致细胞相对荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P<0.01)(见表4)。pcDNA-circFOXK2组HSC3细胞miR-4677-3p表达水平显著低于pcDNA组(P<0.05),si-circFOXK2组HSC3细胞miR-4677-3p表达水平显著高于si-NC组(P<0.05)(见表5)。

表4 双荧光素酶报告实验

表5 circFOXK2调控miR-4677-3p的表达

2.5 干扰miR-4677-3p表达逆转抑制circFOXK2表达对HSC3细胞增殖、侵袭和迁移的作用

si-circFOXK2+anti-miR-4677-3p组HSC3细胞miR-4677-3p表达水平显著低于si-circFOXK2+anti-miR-NC组(P<0.01),MMP-2和MMP-9蛋白水平、细胞OD值、克隆形成数、划痕愈合率、侵袭数显著高于si-circFOXK2+anti-miR-NC组(P<0.01)(见图4、表6)。

表6 干扰miR-4677-3p表达逆转抑制circFOXK2表达对HSC3细胞增殖、侵袭和迁移的作用

3 讨论

circRNA是新发现的功能性调节非编码RNA,特定circRNA差异表达与各种癌症的临床特征显著相关。目前已发现circ_0000140低表达与OSCC病人预后不良相关[6]。circ_101036通过诱导内质网应激来抑制OSCC细胞迁移和侵袭[7]。然而circ_002178高表达OSCC病人晚期病理分期和远端转移发生率较高,敲除circ_002178能够有效抑制OSCC细胞增殖和侵袭[8]。阐明circRNA在OSCC发生和发展机制中的作用将为OSCC的治疗提供新的方向。本研究检测到OSCC组织中circFOXK2表达增加,抑制circFOXK2表达导致HSC3细胞活力和克隆形成数降低,迁移和侵袭能力降低,表明抑制circFOXK2表达具有抗增殖、抗转移作用。肿瘤转移涉及多个步骤,其中MMPs是肿瘤细胞降解细胞外基质并向局部或远处延伸的必要条件[9]。在包括OSCC在内的多种肿瘤中MMP-2和MMP-9异常表达或激活与肿瘤侵袭或转移有关[10-11]。本研究检测转移相关标志蛋白MMP-2和MMP-9的表达水平,结果显示,抑制circFOXK2表达导致HSC3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白下调,transwell实验结果与之一致。以上研究表明circFOXK2在OSCC进展中扮演致癌基因角色。

研究[12-13]显示circRNA可结合miRNA调控肿瘤进展。本研究证实miR-4677-3p是circFOXK2的靶点,过表达circFOXK2可抑制miR-4677-3p表达,而抑制circFOXK2则促进miR-4677-3p表达。miR-4677-3p已被证明在人类癌症中异常表达并调控癌症进展。如在胃癌中miR-4677-3p异常低表达,miR-142-5p的上调可抑制胃癌细胞增殖和迁移[14];LINC00313通过下调miR-4677-3p表达水平,诱导CDK6表达上调,从而促进宫颈癌进展[15];miR-4677-3p还作为TTN-AS1和LINC02418等lncRNA的下游miRNA来抑制肺癌进展[16-17]。本研究中,OSCC组织中miR-4677-3p表达明显降低,过表达miR-4677-3p可下调MMP-2和MMP-9蛋白表达,并抑制HSC3细胞活力、迁移、克隆形成和侵袭能力降低,这与抑制circFOXK2表达的抗癌作用类似。为证实抑制circFOXK2的作用是通过上调miR-4677-3p表达实现的,本研究共转染si-circFOXK2和anti-miR-4677-3p至HSC3细胞,结果显示,下调miR-4677-3p表达显著减弱抑制circFOXK2表达对HSC3细胞恶性行为的影响。这些结果表明circFOXK2靶向miR-4677-3p调控OSCC细胞的恶性行为。然而,本研究并未在动物实验中验证circFOXK2和miR-4677-3p的功能,这将是下一步研究的重点。

总之,本研究表明抑制circFOXK2可通过促进miR-4677-3p表达来抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭,这些发现有助于理解OSCC的发病机制,并可能为OSCC的治疗提供新靶点。