1 800 MHz 电磁辐射暴露对大鼠海马GFAP 表达的“窗口效应”

徐晓霜 ，熊 庆 ，张 媛 ，武慧欣 ，和丽梅 ，木云珍

（1）昆明医科大学公共卫生学院，云南 昆明 650500;2）云南省疾病预防控制中心环境卫生所，云南 昆明 650500;3）昆明医科大学生物医学工程研究院，云南 昆明 650500）

随着科技的发展，电磁相关产品越来越多，人们更加频繁的暴露于电磁辐射（electro magnetic radiation，EMR）中，尤其是用于通信的射频电磁场（RF-EMFs，30 kHz-300 GHz），EMR 可能引起的健康问题也逐渐被广泛关注，特别是对大脑的影响。大脑中的中枢神经系统被确定为最容易受到微波辐射的影响，海马体特别敏感[1]。胶质原纤维酸性蛋白（glial fibriliary acidic protein，GFAP）是大脑组织中的成熟星形胶质细胞所特有的细胞骨架蛋白，它在维持中枢神经系统的生理功能和正常结构方面有极其重要的作用，GFAP 的表达水平升高被认为中枢神经系统受损重要检测指标之一[2]。电磁波生物学“窗口效应”是指只有特定功率密度的电磁辐射使生物体产生生物学效应[3]。而EMR 对人体系统的影响可能取决于辐射的频率、强度和功率，但影响GFAP 的表达的辐射阈值并无清楚报道，本研究通过控制EMR 的频率和强度，而改变功率密度，探究在1 800 MHz电磁辐射暴露SD 大鼠下，不同的功率密度海马组织中GFAP 的表达。

1 材料与方法

1.1 动物分组及电磁辐射暴露

98 只4 周龄SPF 级，雌雄各半的健康SD 大鼠，采取完全随机方法分配7 个对照组和7 个暴露组，每组7 只。动物电磁波暴露分7 批进行，每批一个强度的暴露组（分别对应E0.1、E0.3、E0.5、E0.7、E0.9、E1.0、E1.2 7 组，功率密度分别为0.1 mW/cm2、0.3 mW/cm2、0.5 mW/cm2、0.7 mW/cm2、0.9 mW/cm2、1.0 mW/cm2、1.2 mW/cm2）和每个暴露组对应一个对照组进行虚拟暴露（均为E0.0，功率密度为0 mW/cm2）。本研究通过昆明医科大学动物实验伦理审查（批号：kmmu-2020250）。

实验前使用Model7620 微波辐射测试仪测定暴露室的本底强度。暴露时间每天固定20:00～8:00，持续21 d，控制实验室物理环境条件。本实验设置采用盲法，暴露的强度由本项目负责人设置，动物电磁波暴露操作人员和GFAP表达测定人员以及统计分析人员均不知道动物暴露的分组和强度，待所有实验完成以及统计分析结束后揭盲。

1.2 暴露装置

参照德国电信公司，按照提供给德国国家环境与健康研究中心的毒理所的标准--欧洲数字式GSM 移动通信暴露室而自制的暴露室。可对暴露装置设置产生频率为800～2 400 MHz 微波及不同的功率密度。

1.3 主要仪器设备和测定试剂

Model7620 微波辐射测试仪（美国Narda 公司），TES 电场测试器（中国台湾泰仕电子工业有限公司），CM1900 冰冻切片机（德国莱卡公司），Nikon 90i 电子摄影显微镜（日本尼康公司），Image Pro Plus6.0（IPP6.0）图像分析系统（美国Medical Cybernetics 公司），Amersham Imager 680超灵敏多功能成像仪（美国GE Health 公司），兔抗鼠GFAP 多克隆抗体试剂（美国MILLIPORE 公司），即用型山羊抗兔SP 免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。实验前配置好浓度为4%的多聚甲醛溶液，蔗糖溶液，0.1 mol/L的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）缓冲液，0.01 mol/L的磷酸缓冲盐溶液。

1.4 免疫组化测定大鼠海马组织GFAP

将暴露完成的大鼠用4%的戊巴比妥钠（0.0015 L/1kg）腹腔麻醉，打开大鼠的胸腔后，经过左心室做主动脉插管延伸至升主动脉，以0.002 L/min 速度灌注4%的多聚甲醛溶液30 min，对大鼠脑组织内固定。随后分离大鼠脑组织浸入4%的多聚甲醛溶液中，置于4 ℃冰箱后固定。将脑组织用梯度蔗糖溶液脱水，将海马组织从大鼠脑组织中剥离。最后在-20 ℃下用CM1900 冰冻切片机沿着海马组织长轴进行连续切片，每份切片的厚度均保持在20 µm，每只大鼠作20 张海马组织切片，随机选取3 张冰冻切片进行免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法（streptavidin-peroxidase method，SP 法）染色。在保证所有免疫组化法染色切片的背景吸光度值相同的情况下，在100 倍显微镜下随机选取海马DG 区、CA3 区和CA1 区，每区选择2 个视野在400 倍下进行摄片。摄取后照片采用IPP6.0 图文分析系统测定GFAP 表达量的平均光密度（mean optical density，MOD）值表示，MOD 值越大，表示摄片区域相关蛋白表达量越大，每只动物在海马各区的GFAP 表达量是摄取的合计6 个视野MOD值的平均值。

1.5 Western Blot 测定大鼠海马组织GFAP

各组的大鼠颈椎脱位后，取海马组织加入500 µL RIPA 裂解液和5 µL 蛋白酶抑制剂，利用超声破碎仪破碎海马组织15～20 s，随后以12 000 r/min 离心取上清液。通过BCA 蛋白定量法测定蛋白含量，将每组样品加入5x 上样缓冲液，100 ℃煮15 min。取5 µL 裂解样品进行电泳分离，之后将分离的蛋白湿转移至PVDF 膜。快速封闭液在常温下摇床封闭10 min。随后，GFAP（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃过夜孵育。二抗常温孵育2 h。最后，采用显色成像技术，并使用Image J 软件对成像结果进行灰度值量化分析。

1.6 统计学处理

用SPSS 19.0 软件建立数据库并进行统计分析，GFAP 表达值MOD 值用（）表示。大鼠的性别比以及体重分别用χ2检验和单因素方差分析进行统计分析。对照组和暴露组的MOD 值和相对蛋白表达量用两独立样本t检验或完全随机设计两样本秩和检验，检验水准为0.05。

2 结果

2.1 实验大鼠的基本情况

7 批大鼠暴露期间无死亡，无患病且无异常活动。暴露结束后动物大体解剖和心，肝，肺，肾，胰，脾，生殖系统，大脑病理检查无异常。大鼠性别和体重，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 实验大鼠的基本情况[（），n=7]Tab.1 Basic information of experimental rats[（），n=7]

表1 实验大鼠的基本情况[（），n=7]Tab.1 Basic information of experimental rats[（），n=7]

2.2 免疫组化检测GFAP 在SD 大鼠海马组织各区的表达

SD 大鼠海马组织冰冻切片进行免疫组化法染色，GFAP 在各个视野中均有表达，GFAP 阳性染色呈棕色，星形胶质细胞纤维清晰可见，呈现典型的“蜘蛛样”形态，各组间均未见明显的阳性细胞形态和数量的变化，见图1。各组MOD 值暴露组E0.1 和E0.3 的3 个区GFAP 表达的MOD 值比较差异有统计学意义（P<0.01），见表2。

图1 GFAP 在大鼠海马CA1 区的表达（×400）Fig.1 Expression of GFAP in the CA1 region of the rat hippocampus.（×400）

表2 14 组大鼠海马3 个区GFAP 表达的MOD 值（，n=7）Tab.2 MOD values of GFAP expression in three areas of the hippocampus of rats in 14 groups（，n=7）

表2 14 组大鼠海马3 个区GFAP 表达的MOD 值（，n=7）Tab.2 MOD values of GFAP expression in three areas of the hippocampus of rats in 14 groups（，n=7）

*P <0.05。

2.3 GFAP 在14 组大鼠的海马蛋白表达比较

和对照组相比，Western Blot 电泳检测1 800 MHz 对大鼠海马GFAP 表达的影响。结果显示，暴露组E0.1 组和E0.3 组海马组织中GFAP的表达显著高于对照组（P<0.01），且E0.1 组海马组织中GFAP 的表达显著高于E0.3 组，见图2。

图2 14 组大鼠海马GFAP 蛋白表达表达结果Fig.2 Expression of GFAP protein in the hippocampus of rats in 14 groups

3 讨论

RF-EMF 主要来源于电视信号的发射与接收、无线电通讯、广播等[4]。手机和基站所发出的频率为1 800 MHz，对人体组织稳态有长期、短期的影响，尤其是对大鼠蛋白组成的影响[5]。据报道基站的辐射功率密度为0.6 mW/cm2到2.1 mW/cm2[6]，其中1 800 MHz 的功率密度限值为0.9 mW/cm2[7]。本次所选择的7 个暴露组的功率密度是基于以上综合考虑后的结果。在张盛庆宇、陈洁[8-9]等，研究中表示1 800 MHz 的电磁辐射后，增加了大脑海马中的GFAP 表达。现目前的研究中表明1 800 MHz 的电磁辐射对GFAP 的表达确实有影响，但却未明确其辐射功率密度，为了找到功率密度中的窗口，本研究将辐射功率密度分为7 个组，目的是筛选出功率密度窗，明确在多少功率密度下1 800 MHz 可对GFAP 造成影响。

3.1 在1800MHz 电磁波暴露对GFAP 表达的影响是非线性的

动物实验研究表明，在高功率密度射频辐射的实验条件下大鼠的记忆功能受影响，GFAP 的表达上升[10]。杨美丽等[11-13]学者的研究显示850～1 900 MHz 产前手机辐射会使大鼠后代GFAP 表达上调。马卿鑫和张盛庆宇等[3，9]学者研究1 800 MHz电磁波暴露对大鼠GFAP 表达的影响，两者的研究结果显示不同功率密度的电磁波暴露会使大鼠海马各区的GFAP 表达发生改变，表达下降或上升。本实验最终结果表明，功率密度为0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2的电磁波暴露使大鼠海马各区GFAP表达出现上调，其余功率密度对GFAP 表达无明显影响。由此可知，在该频率电磁辐射条件下产生的生物学效应是非线性的，提示在1 800 MHz下随着电磁波功率密度增加并不会产生更大的生物学效应。

3.2 1 800 MHz 电磁波暴露对大鼠海马GFAP 表达的影响具有“窗口效应”

现有研究表明手机的电磁辐射的功率密度对生物体的影响是有选择性的，张媛，刘松等[14-15]与本研究相同装置产生的1 800 MHz 的电磁辐射，辐射功率密度为0.5 mW/cm2和1.0 mW/cm2的SD 大鼠出现心肌氧化应激反应，可由此推，相应的功率密度可能对大脑的海马也有一定影响。本次结果显示为0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2的暴露组与对照组相比，大鼠海马各区GFAP 表达出现上调，根据密度窗的定义，可将功率密度为0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2认定为1 800 MHz 电磁辐射暴露下SD 大鼠海马组织的GFAP 升高的功率密度窗。本研究为动物实验研究，得到的结果有局限性，能否将此种影响外推于人还需要更多流行病学研究证实。