猪圆环病毒2型疫苗的应用和研发进展

王鹏，沈伟桢，周斌

(1. 南京江北新区农村工作管理服务中心，江苏 南京 211899；2. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

猪圆环病毒(PCV)是一种单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属，是已知最小的动物病毒之一[1]，根据全基因组核苷酸序列可分为PCV1型(PCV1)、2型(PCV2)、3型(PCV3)和4型(PCV4)4个血清型，PCV2又可细分为a～h 8个亚型[2]。猪对PCV2具有较强的易感性，4周龄断奶仔猪最易感，常引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，临床表现多样，渐进性消瘦或生长迟缓是最常见的症状，易与其他病原混合感染，大大提高病猪的死亡率[3]。猪圆环病毒病于1991年在加拿大首次被发现，之后世界各国均有大量报道[4-5]，我国自2001年首次分离到PCV2以来，浙江、山东、广东、河南等省份先后均有该传染病流行的报道发生。目前为止，PCV2经历过2次重大抗原变异：2003年，PCV2b亚型在全球大部分地区取代PCV2a亚型成为主导毒株；2012年，中国、韩国等部分地区的PCV2b亚型开始被PCV2d亚型取代。

全球各国养猪产业正遭受着PCV2引起的严重影响与经济负担，因此疫苗接种被视为预防该病的最有效手段并逐渐成为近年来的主要关注点之一。在此背景下，传统灭活疫苗、亚单位疫苗、嵌合疫苗和合成肽疫苗陆续问世并投入使用，同时实验室也致力于开发新型活载体疫苗、核酸疫苗等，商业疫苗的投入使用和实验室疫苗的不断优化在防控PCV2感染和提高猪群生长性能发挥了重要作用。然而，疫苗佐剂的筛选、PCV2d的流行也为疫苗的研发提出了新的挑战。

1 PCV2疫苗的应用现状

自2006年开始进入我国市场的PCV2商业疫苗(表1，表2)均有报道表明可显著降低PMWS感染猪的临床病理表现并改善其生长性能[6]。在接种疫苗后，猪群的平均日增重和瘦肉产量百分比有所提高，增加了饲料转化率并降低了接种疫苗猪群的药物成本。目前我国商业化的PCV2疫苗主要可以分为2类：灭活疫苗和以衣壳(Cap)蛋白作为免疫原的亚单位疫苗。然而，灭活疫苗通常是在猪肾传代细胞系(PK-15)中生产，有着病毒滴度低的缺点[7]；亚单位疫苗可在大肠杆菌或杆状病毒表达系统中生产，但需要昂贵的超离心或层析纯化[8]。因此，目前研究的重心逐渐偏向于成本更低、安全性更高并且保护作用更持久的活载体疫苗和核酸疫苗。

表1 国内PCV2商品疫苗汇总

表2 国内进口PCV2疫苗汇总

2 传统疫苗

2.1 灭活疫苗

灭活疫苗由于病原微生物已经完全灭活，在使用安全性和储存稳定性等方面相比弱毒疫苗有优势，还具有对母源抗体的中和作用不敏感的优点。最早的PCV2灭活疫苗是法国梅里亚公司于2006年研发的PCV2全病毒灭活疫苗Circovac®[9-11]，疫苗通过欧盟认证，是世界上首个以轻石蜡油为佐剂的PCV2疫苗，同时Circovac®可用于繁育母猪和3周龄以上仔猪，也是目前唯一一个既适用于母猪又适用于仔猪的PCV2疫苗。它能有效降低感染仔猪各组织器官中的病毒载量，降低病毒血症的发生并减轻病毒组织器官的负荷和病毒散播，促进新生仔猪的生长发育。我国最早的PCV2灭活疫苗是南京农业大学姜平教授科研团队研发的PCV2灭活疫苗(SH株)[12]。目前国内灭活疫苗主要基于SH株、LG株、ZJ/C株、DBN-SX07株等毒株研制，均属于PCV2b亚型，在本质上没有区别[13]。

2.2 弱毒疫苗

由于弱毒疫苗毒力容易返强、致弱毒株毒力评价难度较大等问题，截至目前为止市场上还没有针对PCV2的弱毒疫苗。Fenaux等[14]在PK-15细胞中连续传代PCV2分离株达120代后，对第1代病毒(VP1)和最后1代病毒(VP120)在生物学特性、遗传特征上通过试验进行表征，发现从第1代到第120代的过程中，整个病毒基因组发生了2处核苷酸变异：C328G和A573C。这2处变异导致Cap蛋白第110位的脯氨酸变为丙氨酸(P110A)，第191位的精氨酸变为丝氨酸(R191S)。进一步研究发现这些突变增强了PCV2的体外生长能力并减弱了体内感染能力，这一发现对研发出有效的PCV2弱毒疫苗的具有重要指导作用。

3 基因工程疫苗

3.1 亚单位疫苗

目前商业PCV2亚单位疫苗的设计和研发主要基于ORF2所编码的Cap蛋白，它是PCV2的主要结构蛋白和免疫保护性抗原，具有中和性表位和诱导保护性免疫反应的潜力[15-16]。目前国际市场上有3种PCV2亚单位疫苗，分别是CircoFlex®，Circument®和Porcilis PCV®[17]。它们都利用杆状病毒系统表达ORF2制成，经灭活和纯化后病毒样颗粒(VLPs)在形态上与PCV2颗粒相同[8]。一项试验同时评估了Circovac®、CircoFlex®和Porcilis PCV®，结果表明，与商业化灭活疫苗相比，亚单位疫苗CircoFlex®和Porcilis PCV®表现出更低的病毒载量和散播，更温和的组织病理学病变，更高水平的PCV2特异性中和抗体和细胞介导免疫[18]。王琳琳等[19]利用杆状病毒表达系统高效表达Cap蛋白，采用水性佐剂制备成灭活疫苗，仔猪免疫后精神、食欲和行为活动均正常，酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体效价在1∶400～1∶800，具有良好的免疫原性和安全性，可作为预防PCVAD的候选疫苗。Xi等[20]通过大肠杆菌表达重组Cap蛋白，在中性缓冲液中自组装成与完整PCV2病毒相似的VLPs。通过试验证明该蛋白具有良好的免疫原性，能有效刺激机体产生特异性抗体介导的免疫应答，并保护机体免受PCV2-SH毒株的感染，而且生产成本较低，是一种具有潜在竞争力的亚单位疫苗。目前国内注册上市的亚单位疫苗有正圆臻、圆柯欣、圆臻清、圆环力康、易圆净等。

3.2 重组载体疫苗

重组载体疫苗利用基因工程技术以减毒活病毒或细菌作为基因表达载体，将编码特定病原微生物免疫原性蛋白的基因插入载体中，输入机体后在体内表达免疫原性蛋白，从而激发机体产生特异性抗体和细胞免疫应答，预防相应病原微生物的感染[21]。当前PCV2重组载体疫苗主要有腺病毒载体疫苗、伪狂犬病毒载体疫苗以及杆状病毒载体疫苗[22]。

3.2.1 杆状病毒载体疫苗

昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)已成熟应用于多种蛋白的表达中，为疫苗研发提供了大量原材料，适用于多基因表达设计和大规模的无血清培养条件下的重组蛋白生产[23]。He等[24]利用杆状病毒感染的家蚕幼虫和大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统表达了PCV2 Cap蛋白，通过ELISA证实了产生的VLPs的免疫原性，表明杆状病毒感染的家蚕幼虫表达系统是获得PCV2 VLPs的良好选择，具有开发低成本、高效疫苗的潜力。Xu等[25]针对PRRSV GP5蛋白和PCV2 Cap蛋白利用BEVS构建了重组BacSC-Dual-GP5-Cap疫苗，其能产生相当高的病毒中和滴度并诱导淋巴细胞增殖反应，是抵抗两者感染的潜在二价亚单位疫苗。目前国内上市的杆状病毒表达Cap蛋白的载体疫苗有国药集团动物保健股份有限公司的圆力康和扬州优邦生物药品有限公司的圆立优[22]。

3.2.2 腺病毒载体疫苗

腺病毒载体疫苗通过将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中构建而成，具有简单构建和诱导体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫的优势[26]。Li等[27]构建了分泌型重组腺病毒和非分泌型重组腺病毒，ELISA和病毒中和试验(VNT)结果表明，分泌型重组腺病毒诱导的体液免疫应答明显高于PCV2-SH菌株，并且在PCV2攻毒试验中病毒载量显著降低，表明分泌型重组腺病毒疫苗比商业灭活疫苗PCV2-SH菌株能引起更强的免疫应答和更好的保护作用，是一种潜在的PCVAD候选疫苗。为了降低腺病毒蛋白的免疫原性，Li等[28]构建了用Intron A、WPRE修饰和CD40L、GMCSF修饰的PCV2腺病毒载体疫苗，这类修饰后的疫苗诱导了更强的体液和细胞免疫反应，提供了比未修饰疫苗更好的保护作用。然而，腺病毒的靶向性差，首过效应强，且不能整合到靶细胞的基因组DNA中并稳定表达外源基因，因此只有不断优化腺病毒载体以提高其特异性和安全性，才能最大限度发挥它的潜在应用价值[29]。

3.2.3 伪狂犬病毒活载体疫苗

伪狂犬病毒(PRV)因其基因组结构独特、宿主覆盖范围广泛和生物安全性，已成为研发活载体疫苗的重要工具。将表达保护性抗原基因的重组伪狂犬病毒构建疫苗模型，可以预防包括伪狂犬病在内的多种疾病，实现一针多防的目的，而且能简化免疫过程、降低成本，在商业和应用前景上具有潜在优势[30]。Zheng等[31]构建了一种表达PCV2 Cap蛋白和白细胞介素18(IL-18)的重组伪狂犬病毒，用PRV-ORF2- IL18、PRV- ORF2、PRV HB98或灭活的PCV2免疫小鼠，ELISA、VNT、异性淋巴细胞增殖试验、CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞分析显示，PRV-ORF2-IL18在小鼠中可诱导高滴度的血清中和抗体，并产生具有较强的细胞介导免疫应答。PRV-ORF2 - IL18免疫可保护小鼠免受PRV-Fa毒株的致命攻击，并显著降低PCV2病毒血症的数量。PRV-ORF2-IL18重组病毒可能是预防猪PCV2和PRV感染的一种有吸引力的候选疫苗。

3.3 合成肽疫苗

合成肽疫苗是一种仅含有免疫决定簇的短肽疫苗，将根据病原体蛋白质的氨基酸序列合成的保护性短肽与载体结合，再加入佐剂制备而成[32]。Jeong等[33]根据来自欧洲、北美洲和亚洲的不同分离株的氨基酸序列比对来构建Cap蛋白的氨基酸序列并合成小肽，使用氢氧化铝、氧化钴和脂质体为佐剂制备疫苗，结果表明以脂质体佐剂制备的合成肽疫苗免疫效果较好，但整体保护作用较当前商品疫苗略差一些。南京农业大学姜平教授研究团队深入分析PCV2免疫保护抗原和抗原表位后，确定并筛选出由50～51个氨基酸组成的2条多肽序列，成功研制出PCV2合成肽疫苗[34]。疫苗免疫保护效力达100%，免疫持续期4个月，为防控PCVAD提供了又一种重要手段。

3.4 核酸疫苗

核酸疫苗能够直接引入编码特定抗原蛋白的DNA或RNA到免疫动物的细胞中，通过宿主细胞的表达机制转化和翻译外源核酸，形成的抗原蛋白刺激机体产生针对该抗原蛋白的免疫反应，最终达到预防或治疗某种疾病的目的[35]。Sylla等[36]利用pEGFP-N1载体构建PCV2 Cap基因重组疫苗，对80只BALB/c小鼠以2周的间隔接种pEGFP-Cap、LG株疫苗、pEGFP- N1载体或PBS 3次，然后用PCV2攻毒。结果发现，接种pEGFP-Cap的小鼠通过诱导高度特异的血清IgG抗体和细胞因子(γ干扰素和白细胞介素10)，以及较小的PCV2病毒载量，有效地保护了小鼠免受PCV2感染。因此，这项研究表明，重组pEGFP- Cap可显著减轻小鼠的PCV2感染，并提供证据证明DNA疫苗可以替代针对PMWS的PCV2疫苗。由于外源基因在宿主细胞中的表达调控和在细胞间的转移机制研究尚不完善，可能会引起意外的免疫反应和其他问题，因此核酸疫苗的安全性和有效性还需进一步研究验证，这是目前核酸疫苗研究仅限于实验室研究的主要瓶颈原因之一[35]。

3.5 嵌合疫苗

嵌合疫苗能够将2种或多种病原体的基因组或片段通过基因工程技术连接或替换，形成的重组基因能够表达2种或更多的病原体抗原，然后再通过传统方法设计和制造灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗等[37]。美国富道公司将致病性PCV2中的ORF 2片段置换不致病的PCV1中的ORF 2片段，构建了PCV1-2嵌合病毒并将其制成灭活疫苗。多次试验表明，嵌合病毒灭活疫苗能够为猪群提供较好的免疫防护，特别是在抑制病毒和降低病毒血症的效果上有着显著的优势。目前该疫苗已经在美国、加拿大、丹麦和墨西哥等国家获得注册并被广泛使用[38-39]。国内市场上现有的PCV2嵌合疫苗为2019在我国注册上市的硕腾公司生产的PCV1-2型嵌合体灭活疫苗。

4 PCV2联合疫苗

联合疫苗是指将2个或2个以上的疫苗抗原通过混合、联合或同时施用的方式进行免疫接种，从而实现预防多个疾病的疫苗。联合疫苗尤其是多联疫苗在研制和临床试验过程中，应该充分考虑各种组分之间的相互作用以及它们对联合疫苗安全性和有效性的可能影响[40]。国内市场上现有的PCV2联合疫苗种类分为PCV2型、猪肺炎支原体二联疫苗和PCV2型、副猪嗜血杆菌二联疫苗，已获批的国产疫苗有圆支优、圆支康、圆支泰、圆支必宁等。陈昌海等[41]对PCV2灭活疫苗和猪瘟病毒冻干活疫苗联合免疫效果进行了评估，结果表明2种疫苗联合接种并未影响相应抗体的产生，反而在一定程度上发挥了协同作用，促进了2种抗体在猪群个体间的稳定分布。张召等[42]对猪瘟活疫苗、PCV2型基因工程疫苗和猪肺炎支原体灭活疫苗3种疫苗联合免疫的可行性进行评价，发现3种疫苗之间互不干扰，联合免疫效果与单苗免疫一致，而且接种后的猪群在生长性能上表现更优，证明三者联合免疫安全有效。

5 佐剂在PCV2疫苗中的应用

针对各种疫苗接种所需的佐剂而言，其效用与原理各有差异，故而在决定或挑选某种特定疫苗所用的佐剂的过程中，必须全面权衡靶动物种类、疫苗免疫原性质、需要激活的免疫类型、免疫应答的途径以及期望达到的免疫效果等多方面因素[43]。目前PCV2商品疫苗的佐剂主要为化学佐剂和分子佐剂两大类[44]，在灭活疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗等类型的疫苗中都有广泛的应用。赵本进等[45]使用水包油佐剂Merckinade SDA 25、HS1010和双向佐剂Montanide ISA 206制成PCV2灭活疫苗，对3种疫苗的稳定性、黏度、接种仔猪后的有效性和安全性进行评估。结果表明，佐剂Montanide lSA 206相较Merckinade SDA 25可诱导更高水平抗体效价，考虑到佐剂产品的成熟度，确定灭活疫苗使用Montanide ISA 206。孙莹慧等[46]将重组的PCV2 Cap蛋白与与氢氧化铝胶佐剂、ISA 15 AVG佐剂和IMS 251C VG佐剂混合制备疫苗，并选择PCV2阴性仔猪(14日龄)开展动物安全性检验和免疫效力检验。研究结果显示，使用佐剂ISA 15A VG制备的亚单位疫苗，在接种仔猪后可刺激机体产生较高水平的体液免疫应答。刘新月等[47]将IMS 251C VG、GEL 02 PR、ISA 15A VG、ISA 206 VG、ISA 61 VG、台湾细菌鞭毛、卡波姆、多糖共8种佐剂与适量PCV2多肽抗原按照特定方法配制成不同疫苗，采用小鼠试验初步检验疫苗安全性及免疫效果，筛选出较优的佐剂进行仔猪免疫攻毒保护试验，研究结果表明油佐剂ISA 61 VG佐剂和水佐剂GEL 02 PR制备的PCV2合成肽疫苗无安全性问题，且具有极好的体液免疫和细胞免疫反应，对预防PCV2感染具有较好的免疫保护作用，是一种很好的合成肽疫苗佐剂。

分子佐剂能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，它们的形式与传统佐剂不同，是质粒编码的蛋白质，其作用方式依赖靶向先天免疫受体或分子信号转导事件，包括模式识别受体激动剂、细胞因子、趋化因子和免疫靶向基因等[48]。Fu等[49]比较了泛素(Ub)、热休克蛋白70 C端多肽结合区( Hsp70c)和白细胞介素-2(IL-2)这3种分子佐剂在基于PCV2 ORF2基因DNA疫苗中的增强能力，结果表明相较于Hsp70c和IL-2，利用Ub作为分子佐剂可诱导更强的Th1型细胞免疫，血清中Cap蛋白特异性IgG抗体水平也更高，而且在感染后的大部分时间内产生的特异性免疫均强于其他2组。因此，对于PCV2 DNA疫苗接种，Ub是比Hsp70c和IL-2更好的分子佐剂。

6 PCV2疫苗对不同亚型毒株的保护能力

目前PCV2的商业疫苗大多都来源于PCV2a和PCV2b亚型毒株，面对当前流行的主流PCV2d亚型毒株，已有研究者们评估了它们能否提供可靠的保护。Jeong等[50]、Opressing等[9]、黄亚平等[51]使用现有商品PCV2灭活疫苗对流行的PCV2d毒株的免疫保护效果进行评估，Fort等[8]通过试验验证了基于PCV2 Cap蛋白的亚单位疫苗对来自具有不同基因型和地理来源的4种不同 PCV2分离株的保护作用，结果均表明现有商品疫苗能完全保护PCV不同基因型的攻击。然而，Li等[52]比较了基于基因型2b和2d的2种试验性PCV1-2灭活嵌合疫苗的保护能力，结果表明2个疫苗接种组在攻毒后的体液免疫反应、PCV2b载量或 PCV 相关微观病变方面没有显著差异。然而，在接种PCV2b疫苗猪的腹股沟浅表淋巴结中没有检测到来自攻击毒株的DNA，但攻毒后21 d在PCV2d免疫组的1头猪中检测到来自攻击毒株的DNA。Kang等[53]发现在韩国田间分离的PCV2毒株[QIA215(PCV2a)、QIA418(PCV2b)、QIA169(PCV2d)和QIA244(PCV2d)]表现出不同的抗原结合活性，观察到不同基因型之间以及相同基因型的毒株之间存在交叉保护差异。Reiner等[54]也发现了一致的结果，与未接种疫苗的猪群相比，接种疫苗的猪群中感染PCV2a的频率相对降低，而感染PCV2b的情况正好相反。综上所述，当受到异源毒株感染时，目前商品疫苗虽然也能引起对临床综合征的充分保护，并减少病毒复制，但是病毒感染和复制并不能被完全阻止，并且在不太理想的条件下(例如不准确的疫苗接种、免疫抑制、母源免疫下降、伴随感染等)免疫可能不太有效[52]。

7 讨论和展望

目前，国际和国内上应用的PCV2商品疫苗在防治PCVAD方面临床效果较好，且对PCV2感染有效，但由于PCV的高度变异性和免疫逃逸等特点，目前尚未有一种完全有效的疫苗能够提供长期的保护。传统的灭活疫苗具有很强的免疫原性，制备过程简单，成本较低，但在大规模应用中，由于长时间的病毒培养周期，这些疫苗的产量通常无法满足需求并存在安全性较差的问题。新型纯净性较高、安全性较好的基因工程疫苗正在逐渐取代一些传统疫苗，但这些新型疫苗的免疫原性较弱，单独使用时无法引发有效的免疫反应[55]。新上市的的PCV2合成肽疫苗在技术上层面实现了突破性创新，为疫苗的标准化、大规模产业化生产提供了可能，为规模化养殖企业带来了更多选择，有力保障了生猪产业的持续健康发展。然而，单独的基于肽的疫苗，即使包含最佳B细胞和T细胞表位，仍需佐剂和适当的递送系统才能更高效地发挥疫苗效果[33，56]。因此，目前需要开发能够应对疫苗应用范围扩大，并且能够适用于多种给药途径的多样化应用方法的新型免疫佐剂来进一步提高疫苗的免疫效果。

研究表明，当前的PCV2疫苗对于不同亚型的毒株具有保护作用，能够有效地预防临床症状的发展，减轻病毒血症并产生有效的体液和细胞免疫反应。然而，同样也有试验数据表明这些疫苗往往对同源攻击比异源攻击表现出更高的保护作用，并有部分流行病学调查分析和统计评估指出，观察到的PCV2基因型转变通常与地方流行毒株和使用疫苗的不同保护有关[57]。尽管无法得到确切的证实，但从个体试验数据到地区流行调查统计的一致结果均表明了特定基因型疫苗诱导免疫在推动PCV2变异过程中起到了一定作用，从长远来看可能对当前疫苗免疫效力产生不利影响。

随着分子生物学和基因工程技术的不断进步，研究者们在基于现有研究成果的基础上积极探索如何改进、创新PCV2疫苗，比如改良免疫原设计、提高免疫效力、减少副反应等。研发出一种安全高效且生产成本低的PCV2基因工程疫苗，已成为疫苗研发的主流方向，相信随着相关研究的不断深入，一定能研制出理想的疫苗。